مقاله ترانسفورماسیون برنج Oriza sativa بااستفاده از روش in planta

بخشی از مقاله

چکیده:

در طی سالهاي گذشته موفقیتهاي زیادي در ترانسفورماسیون ژنتیکی ایجاد شده است. موثرترین روش انتقال ژن که گیاهان مستعد آن هستند استفاده از اگروباکتریوم و روش in planta می باشد. مهمترین شاخصه این روش عدم استفاده از تکنیکهاي کشت بافت و تولید کالوس است . در این روش خاص از یک سوزن آلوده با محلول اگروباکتریوم به منظور تلقیح بذور برنج در حال جوانه زنی استفاده شد.

دو سویه ي باکتري به نامهاي LBA4404 و EHA105 استفاده شد. دو باکتري فوق در طی سه مرحله و به مدت سه روز کشت داده شدند و ترانسفورماسیون برنج رقم هاشمی با استفاده از روش in planta انجام شد. بدین منظور مایه کوبی بذور در حال جوانه زنی با سوزن آلوده به اگروباکتریوم انجام و بذور در شرایط مناسب براي رشد قرار داده شدند.

به منظور تائید ترانسفورماسیون گیاهان در مرحلهي 4 برگی مورد ارزیابی قرار گرفتند. بدین منظور واکنش زنجیرهاي پلیمراز با پرایمر هاي رفتی برگشتی از پروموتور CaMV35S و تست گاس به منظور بررسی تظاهر ژن بتاگلوکورونیداز انجام شد. نمونهها با طرح آماري کاملاً تصادفی بررسی شدند و اختلاف معنی داري بین دو باکتري فوق در ترانسفورماسیون رقم هاشمی دیده نشد.

مقدمه:

عملکرد برنج و کیفیت آن تحت تاثیر آفات و بیماريها و همچنین اثر تنشهاي زیستی کاهش می یابد. گیاهان مهندسی ژنتیک شده فرصت را براي ایجاد صفات مقاومت در برنج ایجاد می کنند.

ترانسفورماسیون ژنتیکی برنج جزو مهمترین حوزههاي پژوهشی چند سال گذشته بوده است. مقاومت به حشرات ، قارچها، ویروسها، علف کشها، باکتريها و نماتدها با ترانسفورماسیون برنج بدست آمده اند. گیاهان مهندسی شده با ژنهاي مورد نظر می توانند ارزش صنایع غذایی در کشاورزي را افزایش دهند.

متداول ترین روش انتقال ژن خارجی به گیاه شامل روش مکانیکی و بیولوژیکی می باشد. روش بیولوژیکی شامل انتقال ژن به واسطه ي اگروباکتریوم است. انتقال ژن به منظور تولید برنج ترانسژنیک با استفاده از روشهاي بیولوژیکی موفقیت قابل توجهی داشته است. گیاهان تراریخته بوسیله روشهاي مختلفی تولید می شوند. روشهاي مبتنی بر کشت بافت مستلزم عبور از مرحلهي کالوس زایی در شرایط in vitro است.

در طی این باززایی گیاهان تراریخته ممکن است پتانسیل باروري خود را از دست بدهند و یا در معرض تغییرات سوماکلونی قرار گیرند. در نتیجه این گیاهان الگوي مناسبی براي بررسی بیان ژن انتقال یافته نیستند.

ترانسفورماسیون با اگروباکتریوم به دلیل دستکاري آسان، راندمان بالا، قابلیت انتقال قطعات بزرگ DNA، بیشترین الگوهاي قابل پیشبینی از DNA خارجی الحاق یافته، تعداد نسخه کم و هزینه کم آن بسیار مفید گزارش شده است. - 6و5و4و - 3 هایی و همکاران - 1994 - نشان داده اند که کارایی انتقال ژن به برنج با استفاده از اگروباکتریوم نسبت به انتقال ژن به دولپهايها موفقیت آمیز بودهاست، این محققین برنج ژاپونیکا را با کمک اگروباکتریوم سویهي LBA4404 ترانسفورم کرده اند

رشید و همکاران - - 1996 موفقیت انتقال ژن را با روشی مشابه در رقم ایندیکا گزارش کردند. آلدمیتا و هادجس - 1996 - نشان دادهاند که جنینهاي نابالغ نیز مناسب براي انتقال ژن هستند. آبدینیا و همکاران - 1997 - یک رقم استرالیایی را به واسطهي اگروباکتریوم ترانسفورم کردند. موهانتی - 1999 - ترانسفورم موفقیت آمیز رقم باسماتی را در نسل R2 گزارش داد.

یکی از روشهاي ترانسفورماسیون بدون نیاز به کشت بافت روش in planta است. این روش شامل استفاده از یک سوزن آلوده با اگروباکتریوم به منظور تلقیح بذور برنج در حال جوانه زنی است.

مواد و روشها:

سویههاي باکتري، پلاسمید و مواد گیاهی: در این تحقیق از سویههاي اگروباکتریوم LBA4404 و EHA105 استفاده شد. همچنین از پلاسمید - PCAMBIA1105.IR موسسه کانبرا، استرالیا - تهیه شد. این پلاسمید داراي پرومتور قوي CAMV35Sو ژن GUSplus است که باعث رنگپذیري سریع تحت تاثیر سوبسترا میشود. رقم برنج هاشمی، از موسسهي تحقیقات برنج، رشت، تهیه و استفاده شد.

ترانسفورماسیون بذور با اگروباکتریوم: به منظور آماده سازي بذور براي ترانسفورماسیون، ابتدا بذور ضدعفونی شدند سپس به مدت دو روز در تاریکی در دماي 20 درجه سانتیگراد، به منظور ظهور منطقهي جنینی، در اتاقک رشد قرار گرفتند. سویههاي باکتري در محیط کشت 10g/l - LB پپتون، 10g/l عصاره مخمر، NaCl 5g/l ، - pH=7 به همراه آنتی بیوتیکهاي ریفامپیسین - - 100µg/ml و اسپکتینومایسین - - 100µg/ml بر اساس روش گلوین - 5 - طی سه مرحله کشت داده شدند. پس از آن سوزن آلوده به اگروباکتریوم براي تلقیح بذور در ناحیه جنینی استفاده شد. بذور مذکور در تاریکی به مدت 9 روز در اتاقک رشد در دماي 23 درجه سانتیگراد قرار گرفته تا جوانه بزنند و بعد از این مدت با آنتی بیوتیک سفوتاکسیم - 1000 ppm - تیمار شدند.

تشخیص گیاهان تراریخته احتمالی در ماههاي اولیه ي رشد براي محقق بسیار مهم خواهد بود و می تواند وقت، دقت و کار بیشتري را صرف رسیدگی و پرورش این گیاهان ارزشمند جهت رشد کافی و دستیابی به سیستم ریشهاي مناسب نماید. بدین منظور گیاهچهها در شرایط هیدروپونیک در محیط تغذیهاي Yoshida قرار داده شدند سپس گیاهچهها وارد گلدان شده و به گلخانه انتقال یافتند. استخراج DNA از گیاهچه ها با روش CTAB تغییر یافته انجام شد.

واکنش : PCR واکنش PCR با استفاده از آغازگرهاي CaMV35S جهت تأیید ترانسفورماسیون استفاده شد که از مواد DNA الگو 1µg، پرایمرهاي رفتی 5´-gaa ctc gcc gta aag act gg-3´ و برگشتی-5´- cca cta tcc ttc gca aga cc 3´ هر کدام 1µg، DNTPs 1µg، MgCl 1.5µl، 12.3µl 10Xbuffer و Taq 0.2 µl polymerase با چرخههاي دمایی واسرشته سازي اولیه 95 و 35 سیکل به صورت واسرشته سازي 95، دماي اتصال آغازگر 60، بسط آغازگر 72 به ترتیب در 5 دقیقه، 30 ثانیه، 30 ثانیه، 30 ثانیه و بسط نهایی 72 درجه سانتیگراد 10 دقیقه انجام شد و محصول PCR روي ژل آگارز %1 بررسی شد.

رنگآمیزي براي ارزیابی تظاهر ژن بتاگلوکورونیداز: آزمایش هیستوشیمیایی GUS براي نمونههاي تراریخته با روش جفرسن - 1987 - انجام شد. آنزیم GUS روي سوبستراي X-gluc اثر گذاشته و فراوردهي واکنش به رنگ آبی در نمونههاي تراریخته تظاهر مینماید. ابتدا قطعات برگی در محلول رنگدهی قرار داده شدند و بعد از حذف محلول فوق نمونهها داخل محلول تثبیت کننده حاوي اتانل %50، فرمالدهید %10، اسیداستیک %10 در دماي اتاق به مدت 10 دقیقه قرار داده شدند و بعد از حذف محلول فوق از اتانل %70 استفاده شد و سپس نمونهها براي تظاهر ژن بتاگلوکورونیداز بررسی شدند.

دادههاي بدست آمده از آزمایش در طرحکاملاً تصادفی در شش تکرار بررسی شدند.

نتایج و بحث:

با توجه به پیشرفتهاي اخیر در سیستم کشت بافت براي کاهش تولید گیاهان شیمر، تلاش براي انتخاب تک سلولهاي ترانسفورم شده و باززایی آنها به گیاه کامل با احتمال وقوع بیشتر تنوع سوماکلونال همراه بوده است. بنابراین، استفاده از روشهاي in planta میتواند در زمینه کاهش تنوع سوماکلونال مؤثر باشد. از آنجایی که باکتري بافت زخم شده را آلوده میکند، به منظور افزایش ورود باکتري به بذر از سوزن تلقیح استفاده می شود. روش ترانسفور ماسیون in planta شامل یک سوزن آلوده شده با محلول اگروباکتریوم به منظور تلقیح بذرهاي برنج در حال جوانه زنی است

به منظور انتقال ژن به نسل بعد باید مریستم انتهایی جنین که در تولید سلولهاي زایشی دخیل است توسط سوزن تلقیح شود. زیرا در صورت ترانسفورماسیون سلول هاي زایشی ژن انتقالی به نسل بعد انتقال مییابد. بنابراین بهترین حالت براي تلیقح، کنار مریستم انتهایی ساقهچه بذرهاي جنینی است که بعداً ساقهچه از این مکان خارج میشود. با وجود این اگر سوزن مستقیما به درون ساقهچه جنینی بذرها وارد شود، ساقه چه ممکن است به شدت تخریب شده و در مرحله نمو بعدي از بین برود.

استخراج DNA از نمونههاي برگی انجام شد و غلظت آنها روي ژل آگارز %1 بررسی شد. به منظور تأیید حضور DNA خارجی در گیاهان ترانسفورم شده در سطح مولکولی، واکنش PCR با استفاده از آغازگرهاي CaMV35S انجام شد، که یک قطعه bp 450 را تکثیر میکند. آزمون گاس از نمونههاي برگی انجام شد.