بخشی از مقاله
چکیده
شنبلیله به عنوان یک گیاه دارویی، زراعی، مرتعی، آرایشی و بهداشتی حائز اهمیت فراوان است. امروزه تکثیر و اصلاح بسیاری از گیاهان مهم در سطح جهان با استفاده از روشهای کشت بافت و سلول گیاهی بوده است. در واقع استفاده از تکنیک کشت بافت به عنوان روشی جایگزین برای تکثیر ژنوتیپهای برتر گیاهان مختلف میباشد.
در این پژوهش اثر تیمار لیزر قبل از کشت بذر و همچنین اثر تنظیمکنندههای رشد نفتالین استیک اسید و بنزیل آمینو پورین - هر کدام در سه سطح 0، 0/5 و 1 میلیگرم بر لیتر - به صورت تکی و ترکیبهای دوگانه و سه گانه با نور لیزر بر میزان تریگونلین حاصل از ریزنمونه هیپوکوتیل گیاه شنبلیله مورد بررسی قرار گرفتپژوهش. به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا گردید.
نتایج نشان داد، بیشترین میزان تریگونلین در تیمار 1 پیپیام نفتالین استیک اسید 1 + پیپیام بنزیل آمینو پورین بدون لیزر با میزان 0/0308 گرم و کمترین میزان در تیمار 0/5 پیپیام نفتالین استیک اسید 0/5 + پیپیام بنزیل آمینو پورین به همراه لیزر با میزان 0/0117 گرم حاصل شد. نوع و غلظت تنظیمکنندههای رشد و همچنین تناسب میان اکسین و سیتوکینین، بیشترین تأثیر را بر میزان تریگونلین نشان دادند.
مقدمه
کشت بافت گیاهی، از روشهای پایه علوم گیاهی و مقدمهای در زیست فنآوری و ریزازدیادی یا به عبارت دیگر تکثیر و تولید انبوه گیاهان از طریق فنون مختلف است که عمومیترین روش برای ازدیاد برخی از گیاهان محسوب میشود
باززایی گیاهان و رشد و نمو آن در محیط کشت به عوامل مختلفی نظیر ژنوتیپ گیاه، نوع و منشأ قطعات جداکشت، نوع و غلظت تنظیمکنندههای رشد، فاکتورهای فیزیکی رشد از قبیل نور، دما، pH، غلظت دیاکسید کربن و اکسیژن، مواد غذایی، آب، عناصر پرمصرف و کممصرف، منبع قندی و برخی مواد آلی از قبیل ویتامینها بستگی دارد
تمایز و اندامزایی بافتهای گیاهی فقط در پاسخ به یک یا چند گروه از هورمونها شامل سیتوکینینها، اکسینها، جیبرلینها و اسیدآبسزیک صورت میگیرد. نسبت اکسینها به سیتوکینینها در محیط کشت بافت میتواند روند تشکیل کالوس، ریشهزایی و ساقهزایی در محیط کشت را تحت تأثیر قرار دهد
همچنین استفاده از روشهای بیوفیزیکی در فرآیند تولید محصول، یکی از بهترین راههای ممکن در این زمینه باشد. در روش بیوفیزیکی علاوه بر پاک نگهداشتن محیط زیست، محصولات تولید شده از جهت مصرف انسان از سلامت بالاتری برخوردار میباشند، زیرا در آنها استفاده از مواد شیمیایی به حداقل ممکن رسیده است. همچنین در این روشها بازدهی محصولات تولید شده در سطح مناسبی قابل افزایش میباشد. از میان روشهای بیوفیزیکی، استفاده از نور لیزر امروزه بسیار مورد توجه قرار دارد
شنبلیله با نام علمی Trigonella foenum graecum L. و نام انگلیسی Fenugreek، گیاهی علفی، یکساله و دولپه متعلق به زیر خانواده پروانهآساها و خانواده Leguminosae میباشد. شنبلیله از نظر دارویی حائز اهمیت فراوان است. در ایران برگهای گیاه شنبلیله به صورت تازه و خشک مصرف میگردد. این گیاه دارای ارزش غذایی بالایی است و عناصر معدنی نظیر کلسیم، فسفر، پتاسیم، سدیم، آهن، کاروتن، ویتامین C، B12، اسید آسکوربیک، تیامین، ریبوفلاوین و پروتئین در برگ شنبلیله وجود دارد. همچنین جوانههای آن سرشار از ویتامین A و فسفر میباشد
بذر گیاه شنبلیله منبع تولید تجاری مهمی از متابولیتهای دارویی با ارزشی نظیر تریگونلین و دیوسژنین میباشد . - Minorsky, 2002 - تریگونلین یک ترکیب آلکالوئیدی است که دارای نقش هورمونی در گیاهان میباشد. محققان نقشهای فیزیولوژیکی متفاوتی نظیر، عامل فعال در حرکت برگها، ایجاد مقاومت در برابر تنشهای زیستی و غیر زیستی و عامل حفظ فشار تورژسانس برگ در گیاه را برای متابولیت تریگونلین گزارش کردهاند.
با توجه به اهمیت تابش نور لیزر بر بذر، مهمترین انتظارات اثرات تابش نور لیزر بر بذر گیاهان مختلف را با توجه به مطالعات صورت گرفته تاکنون، میتوان به صورت ذیل خلاصه نمود: افزایش جوانهزنی بذر، کاهش استفاده از بذر، افزایش توده ریشه، افزایش مقاومت به خشکسالی، افزایش مقاومت به آفات و بیماری، ویژگیهای بهتر کیفی محصولات نظیر پروتئین، قند، ویتامینها و دیگر متابولیتهای مفید، کاهش استفاده از کودهای معدنی، کاهش تقاضای استفاده از سموم، محصولات امنتر با کیفیت بالاتر، کاهش آلودگیهای سطح زمین و منابع آب و همچنین کاهش هزینههای تولید.
در این پژوهش به بررسی اثر نور لیزر قبل از کشت و همچنین اثر تنظیمکنندههای رشد اکسین و سیتوکینین در غلظتهای مختلف در محیط کشت بافت بر میزان تریگونلین حاصل از ریزنمونههای هیپوکوتیل پرداخته شد.
مواد و روشها
این پژوهش به صورت فاکتوریل،در قالب طرح کاملاً تصادفی، با 5 ریز نمونه و در 5تکرار که جمعاً 135 پلات آزمایشی - هر پلات شامل یک شیشه آزمایشگاهی - بود، در آزمایشگاه کشت بافت گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان - خوراسگان - انجام شد. بدین منظور اثر تیمار لیزر نور قرمز با طول موج 632 نانومتر به مدت 15 دقیقه قبل از کاشت بذور و اثر تنظیمکنندههای رشد گیاهی از جمله، نفتالین استیک اسید - در سه سطح 0، 0/5 و 1 میلی-گرم بر لیتر - و بنزیل آمینو پورین - در سه سطح 0، 0/5 و 1 میلیگرم بر لیتر - ، به صورت تکی و ترکیبهای دوگانه و همچنین تیمار لیزر به صورت تنها و در ترکیب با تیمارهای هورمونی، در محیط کشت بافت بر میزان تریگونلین حاصل از ریزنمونه هیپوکوتیل گیاه شنبلیله مورد ارزیابی قرار گرفت
. در این پژوهش از محیط کشت موراشیگ-اسکوگ جهت فرآیند ریزازدیادی استفاده گردید. بدین منظور قبل از کشت، بذور با لیزر نور قرمز تیمار گردید. سپس در محیط کشت موراشیگ- اسکوگ قرار داده شد. بعد از رشد و نمو گیاه در محیط کشت، قطعات هیپوکوتیل جدا کشت به محیط کشت موراشیگ- اسکوگ پایه، حاوی نفتالین استیک اسید و بنزیل آمینو پورین انتقال داده شد.
برای تعیین میزان تریگونلین از دستگاه - Knauer, Germany - HPLC با دکتور UV استفاده شد. ستون مورد استفاده x 4.6 mm I.D., 5 C18, 25 Cm - m - ، فاز متحرک استونیتریل: آب - 90:10 - با شارش 1 میلیلیتر در دقیقه و طول موج مورد استفاده 632 نانومتر بود. شناسایی و اندازهگیری تریگونلین به کمک مقایسه زمان بازداری نمونهها با ماده استاندارد - سیگما - صورت گرفت - رونجای و همکاران، - 2010نهایتاً. تجزیه تحلیل دادهها با استفاده از نرم افزار SPSS و روش ANOVA صورت گرفت. همچنین مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح کمتر از 0/05 مورد بررسی قرار گرفت. جهت رسم نمودارها و جداول نیز از نرمافزار Excel استفاده گردید.
نتایج
میزان تریگونلین حاصل از ریزنمونههای هیپوکوتیل
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد، اثر تیمار لیزر و تنظیمکنندههای رشد به تنهایی و همچنین اثر ترکیبی تنظیمکنندههای رشد با یکدیگر و اثر ترکیبی تنظیمکنندههای رشد و لیزر بر میزان تریگونلین گیاه شنبلیله حاصل از ریزنمونههای هیپوکوتیل در سطح 0/1 درصد معنیدار گردید - جدول . - 1 نتایج حاصل از مقایسه میانگینها نشان داد، اثر ترکیبی تیمار تنظیمکنندههای رشد و لیزر بر میزان تریگونلین حاصل از ریزنمونههای هیپوکوتیل گیاه شنبلیله در سطح 5 درصد آزمون دانکن معنیدار شد.
نتایج نشان داد تنها در برخی از تیمارها از جمله تیمارهای 0/5 پیپیام نفتالین استیک اسید 1 + پیپیام بنزیل آمینو پورین به همراه لیزر و بدون لیزر، 1 پیپیام نفتالین استیک اسید به همراه لیزر، 1 پیپیام نفتالین استیک اسید 1 + پیپیام بنزیل آمینو پورین بدون لیزر و 0/5 پیپیام نفتالین استیک اسید 0/5 + پیپیام بنزیل آمینو پورین به همراه لیزر، کالوس تشکیل شد که در بین این تیمارها، بیشترین میزان تریگونلین در تیمار 1 پیپیام نفتالین استیک اسید 1 + پیپیام بنزیل آمینو پورین بدون لیزر با میزان 0/0308 گرم بود. در حالی که کمترین میزان تریگونلین در تیمار 0/5 پیپیام نفتالین استیک اسید 0/5 + پیپیام بنزیل آمینو پورین به همراه لیزر با میزان 0/0117 گرم حاصل شد. در سایر تیمارها نیز کالوس شکل نگرفت
جدول - 1 - نتایج تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف بر میزان تریگونلین هیپوکوتیل شنبلیله
تیمارهای مورد بررسی
شکل - 1 - مقایسه میانگین اثر ترکیبی لیزر BAP + NAA + بر میزان تریگونلین حاصل از ریزنمونههای هیپوکوتیل. هر دو میانگینی که حداقل دارای یک حرف مشابه میباشند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد فاقد تفاوت معنیدار هستند.
بحث و نتیجه گیری
امروزه پژوهش در زمینه گیاهان دارویی اهمیت فوقالعادهای داشته که توجه محققان زیادی را به خود معطوف ساخته است. نظر به روند کند تولید مواد دارویی در گیاهان، بسیاری از محققان به تکنیک کشت بافت روی آوردهاند تا با استفاده از این روش ضمن کوتاه کردن چرخه تولید، باعث افزایش راندمان محصول نیز شوند
کشت سلول گیاهی یک منبع مناسب و مهم برای تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش در اکثر گیاهان است. نوع و مقدار اکسین یا سیتوکینین، یا نسبت اکسین به سیتوکینین، تشکیل و تجمع متابولیتهای ثانویه را در سلولهای گیاهی کشت شده تغییر میدهد
نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد، کشت ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط کشت موراشیگ - اسکوگ حاوی تنظیمکنندههای رشد، تنها در برخی از تیمارها منجر به تشکیل کالوس گردید در حالی که در برخی از تیمارها کالوس شکل نگرفت. بر طبق نتایج، در بین غلظتهای مختلف تنظیمکنندههای رشد، غلظت 1 پیپیام نفتالین استیک اسید 1 + پیپیام بنزیل آمینو پورین بدون تیمار لیزر، بیشترین میزان تریگونلین را در ریزنمونههای هیپوکوتیل نشان داد.
