بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی گونههاي حیوانی استفاده شده در فرآوردههاي پروتئینی مورد مصرف انسان به لحاظ اقتصادي، عقاید مذهبی و بهداشتی بسیار حائز اهمیت می باشند. هدف از این تحقیق تشخیص وجود تقلب و شناسایی گونههاي استفاده شده - نشخوارکنندگان، طیور و خوك سانان - در سوسیس، کالباس و گوشت چرخ کرده با استفاده ازروشهاي مبتنی بر واکنش زنجیره اي پلیمراز بود. بدین منظور از سوسیس، کالباس و گوشت چرخ کرده به ترتیب تعداد 10 نمونه متعلق به شرکت هاي مختلف جمع آوري شد. استخراج DNA از نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات- سیلیکاژل صورت گرفت.
قطعات 104، 183 و 290 جفت بازي به ترتیب براي نشخوار کنندگان - گاو، گوسفند و بز - ، طیور - مرغ و بوقلمون - و خوك سانان - اهلی و وحشی - از نواحی ژنی 12s rRNA و 16s rRNA، DNA میتوکندري با استفاده از واکنش زنجیره اي پلیمراز به صورت Multiplex و آغازگرهاي اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوك سانان تکثیر شدند. نتایج نشان دادند که نمونههاي سوسیس، کالباس و گوشت چرخ کرده جمع آوري شده هیچگونه آلودگی به بقایاي بافتی خوك سانان نداشتند. اما 80 درصد نمونه هاي سوسیس و90 درصد نمونه هاي کالباس آلودگی به بقایاي بافتی طیور را نشان دادند. همچنین نمونه هاي گوشت چرخ کرده نیز عاري از آلودگی به بافت طیور بودند.
مقدمه
خریداران نیاز به اطلاعات شفاف و دقیق جهت خرید مواد غذایی دارند. که بر اساس شیوه و سبک زندگی، مذهب و سلامت عمومی مواد غذایی مورد نیاز خود را خریداري می نمایند . - 11 - تشخیص گونه هاي استفاده شده در مواد غذایی از نظر کنترل برخی از بیماري ها اهمیت ویژه اي دارد که در این بین بیماري هاي مغزي عصبی کشنده و قابل انتقال 1 - TSEs - در طی چند سال اخیر اهمیت زیادي پیدا نموده اند . - 8 - بر مبناي دسته بندي ون هولست و همکاران 10 - و - 9 پنج روش براي تشخیص ناخالصی ها در مواد غذایی صنعتی فرآوري شده و خوراك دام و طیور در آزمایشگاه ها و مراکز تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرند که شامل:
-1 روش ریزبینی - میکروسکوپی - ،
-2 روش طیف سنجی فروسرخ
-3 روش
ELISA، -4 روش کروماتوگرافی مایع 3 - HPLC -
-5 روش واکنش زنجیره اي پلی مراز - PCR - که بر اساس تعیین توالیهاي DNA هدف است. از مزیتهاي روش PCR نسبت به سایر روش ها می توان دقت فراوان، سرعت زیاد، حساسیت بالا و انعطاف پذیري این روش نسبت به سایر روشها اشاره کرد . - 7 - براي نخستین بار چیکونی - 1994 - 4 از روش PCR جهت شناسایی تقلب در گوشت و فرآورده هاي گوشتی جانوران اهلی استفاده نمود و سپس فی5 و همکاران در سال 1996 نیز این روش را مورد ارزیابی قرار دادند - 6 و. - 4 بوترو1 و همکاران - 2003 - با استفاده از نواحی 12s rRNA و 16s rRNA از DNA ژنومی میتوکندري نسبت به طراحی آغازگرهایی به صورت Multiplex جهت بررسی و شناسایی تقلب در فرآورده هاي لبنی اقدام نمودند.
این افراد تکنیک Multiplex PCR را روشی حساس و قابل اعتماد نسبت به سایر تکنیکهاي رایج PCR و اثبات وجود تقلب در مواد غذایی و خوراك دام و طیور فقط با استفاده از یک واکنش PCR
عنوان نمودند. همچنین آنها بر صحت نتایج حاصله و حساسیت و دقت بالاي این روش بسیار تأکید نمودند . - 3 - هدف اصلی از این تحقیق توسعه و بهینه نمودن Multiplex PCR از نواحی ژنی 12s rRNA و 16s rRNA براي تشخیص نشخوار کنندگان، طیور و خوك سانان در سوسیس و کالباس بود. به کمک این روش می توان گونه هاي حیوانی استفاده شده در سایر مواد غذایی را از
یکدیگر متمایز نمود.
مواد و روشها
پس از هموژن نمودن نمونه ها با ازت مایع، خارج نمودن روغن و چربی از سوسیس، کالباس و گوشت چرخ کرده با استفاده از متانول- کلروفورم و آب با نسبت - 2 :1 : 0/8 - انجام شد. استخراج DNA از نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات – سلیکاژل - بوم2 و همکاران - 1990 صورت گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از روش نورسنجی3 تعین شد. واکنش PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی نشخوار، طیور و خوك سانان - 5 - ذکر شده در جدول-1 براي بررسی آلودگی احتمالی نمونه هاي سوسیس، کالباس و گوشت چرخ کرده به گونه هاي فوق توسط دستگاه ترموسایکلر - T personal, Biometra, - Germany بر اساس روش استاندارد انجام شد.
اجزاي واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر و غلظت نهایی مواد به صورت زیر بود: - 100 mM Tris-HCl - pH 8.8 ، 1/5 U آنزیم Taq پلیمراز، 0/1 میلی گرم بر میلی لیتر BSA، 0/4 mM از هر dNTP، 2/5 mM از MgCl2، 20، 20 و 5 پیکامول به ترتیب از آغازگرهاي نشخوارکنندگان، طیور و خوك سانان و 200 نانوگرم از DNA هدف که با استفاده از برنامه حرارتی زیر و در 35 سیکل تکثیر شدند: 94 درجه سانتی گراد براي 10 دقیقه، 94 درجه سانتی گراد براي 30 ثانیه، 60 درجه سانتی گراد براي 50 ثانیه، 72 درجه سانتی گراد براي 1 دقیقه و 72 درجه سانتی گراد براي 10 دقیقه. محصولات PCR بر روي ژل آگارز %2 به مدت 60 دقیقه و با ولتاژ 90 ولت الکتروفورز شده و ژل مربوطه پس از رنگ آمیزي توسط اتیدیوم بروماید براي بررسی محصولات توسط اشعه ماوراي بنفش بررسی شد.
نتایج و بحث
نتایج نورسنجی نشان داد که DNA هاي استخراج شده از کیفیت مناسبی براي انجام PCR برخوردار هستند. الگوي باندي مربوط به کنترل مثبت استفاده شده در این آزمایش تأیید کننده اختصاصی بودن باندهاي حاصل از آغازگرهاي اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوك سانان است. از طرفی عدم مشاهده باند درکنترل منفی نشان دهنده دقت و صحت نتایج آزمایش است. در الکتروفورز ژل آگارز محصولات PCR با آغازگرهاي اختصاصی خوك سانان در نمونه هاي مورد آزمایش هیچگونه باندي مشاهده نشد
می توان نتیجه گرفت که در هیچ یک از نمونه هاي سوسیس، کالباس و گوشت چرخ کرده مورد استفاده در این آزمایش، قطعه اي تولید نگردیده است و لذا نتیجه گیري می شود که هیچ یک از نمونه هاي مورد آزمایش، به بافت خوك سانان آلوده نبودند. اما در مجموع در 8 نمونه سوسیس و 9 نمونه کالباس آلودگی به بقایی بافتی طیور مشاهده گردید که در شکل-1 مشخص گردیده است. همچنین نمونه هاي گوشت چرخ کرده نیز عاري از آلودگی به بافت طیور بودند. سه ناحیه DNA ژنومی، DNA میتوکندریایی و RNA به عنوان نشانگرهایی بالقوه براي توالی هاي DNA، امکان شناسایی و تمایز بین گونه ها را ممکن کرده اند .
- 1 - از آنجاییکه DNA میتوکندریایی و RNA نسخه هاي زیادي به ازاي هر سلول دارند، مولکول هاي مناسبی براي آزمونهاي تشخیصی با روش PCR می باشند . - 1 - نتایج حاصله نشان دهنده ضرورت گنجاندن آزمون هاي مبتنی بر PCR در استاندارد ملی ایران براي افزایش کیفیت فرآورده هاي پروتئینی است. که براي این منظور روش Multiplex که در این تحقیق استفاده و بهینه شد می تواند جهت کنترل مواد غذایی به لحاظ بررسی تقلب مورد استفاده قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
از قطب علمی علوم دامی و آزمایشگاه بیوتکنولوژي حیوانی دانشگاه فردوسی مشهد، و همچنین آزمایشگاه بیوتکنولوژي پژوهشکده بیوتکنولوژي منطقه شمال کشور - رشت - صمیمانه تشکر می شود.
