بخشی از مقاله
چکیده:
باکتری لیستریا مونوسیتوژن یکی ازمهمترین باکتری های بیماری زای منتقله از مواد غذایی بوده و در حال حاضر کنترل آن مهمترین چالش در کارخانجات صنایع غذایی محسوب می شود . هدف از این مطالعه بررسی اثر اسانس نعناع فلفلی در کنترل رشدلیستریا مونوسیتوژن در گوشت چرخ شده ی کپور نقره¬ای می باشد. آنالیز ترکیب های تشکیل دهنده اسانس نعناع با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف سنج جرمی - GC- MS - انجام گردید. در این تحقیق به نمونه های گوشت چرخ شده، باکتری لیستریا مونوسیتوژن با لوگ 3 در هر گرم تلقیح شد، سپس تیمارهای نعناع فلفلی در غلظتهای 1 - ، 2، 4 درصد - به نمونه ها اضافه شدند. شمارش لیستریا مونوسیتوژن در روزهای 0 - ، 1، 3، 5، 7، 9، - 11 انجام گردید. نتایج نشان داد، که غلظت 4 درصد اسانس اثرات بازدارندگی بر لیستریا بوده است. بنابر این با توجه به نتایج بدست آمده می توان گفت که از اسانس نعناع فلفلی می توان بعنوان یک نگهدارنده طبیعی در کنترل باکتری لیستریا مونوسیتوژن استفاده نمود.
واژگان کلیدی: لیستریا مونوسیتوژن، اسانس نعناع فلفلی، خاصیت آنتی باکتریال، کپور نقره ای
-1 مقدمه:
لیستریا یک باکتری گرم مثبت ، کوچک و به شکل میله ای است که به دمای بالا حساس می باشد.[3] این باکتری بطور وسیعی در نقاط مختلف گسترش دارد6]و.[5 سلول های این باکتری قادرند در محیط های خشک، مرطوب، نمکی و در محیط بدون اکسیژن زنده بمانند .[7] اگرچه رابطه مستقیمی بین شیوع لیستریا و آلودگی مواد غذائی دریائی گزارش نشده ولی این باکتری از فرآورده های دریائی خام و فرآوری شده، جداسازی شده است.[8] باکتری لیستریا از نظر مسمومیت غذایی و بیماری لیستریوزیس که در انسان ایجاد می کند اهمیت خاصی برخوردار است 11]و].10 در سال های اخیر کاربرد مصرف اسانس های گیاهی در مواد غذایی خام به خصوص مواد غذایی فرآوری شده به عنوان جایگزین مناسبی برای مواد نگهدارنده سنتتیک و افزودنی های شیمیایی افزایش یافته است 22]و].17
نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperita L. که نام عمومی آن Peppermintاست، متعلق به خانواده Lamiaceae می-باشد13]و.[4 این گیاه گونه¬ای هیبرید است و از تلاقی بین گونه¬های Mentha aquatica و Mentha spicata حاصل شده است .[19] بومی مناطق معتدله دنیا به ویژه اروپا، آمریکای شمالی و شمال آفریقا می¬باشد، اما امروزه در سراسر دنیا کشت می¬شود .[20] این گونه¬ی نعناع از گیاهان دارویی بسیار مهم محسوب می¬شود و حاوی اسانس فراوانی می¬باشد. در طب سنتی از گیاه خشک شده نعناع فلفلی و اسانس آن برای کاهش اشتها، سرماخوردگی، سرفه، تب، تهوع، سردرد استفاده شده و همچنین دارای اثرات ضداسپاسم، ضدنفخ و سوءهاضمه می¬باشد21]و]. 13 اسانس گیاه نعناع فلفلی با دارا بودن ترکیباتی از جمله سینئول، لیمونن، لینالول و منتول دارای فعالیت ضدباکتریایی و ضد ویروسی است .[9] عمده¬ترین جزء اسانس نعناع منتول است که جزء مونوترپن¬ها می¬باشد. هدف از انجام این مطالعه بررسی خواص ضدباکتریایی اسانس نعناع فلفلی بروی باکتری لیستریا مونوسیتوژن در گوشت چرخ شده ی کپور نقره¬ای بود .
-2 مواد و روشها تهیه اسانس:
در این پژوهش برای استخراج و اندازهگیری اسانس، بوته¬ها در دمای اتاق - حدود 25 درجه سانتی گراد - و در سایه خشک گردیدند و سپس با استفاده از دستگاه کلونجر و روش تقطیر با آب، اسانس¬گیری شدند. تعیین ترکیبات اسانس با استفاده از دستگاه GC/Massانجام شد. از هر نمونه خشک شده 100 گرم آسیاب گردید و به مدت دو ساعت با استفاده از روش تقطیر با آب، اسانس گیری - Gerhart - و درصد آن تعیین شد. ].8] ترکیب¬های تشکیلدهنده فرجه تجاری توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی مجهز به طیف سنج جرمی - GC/MS - - کروماتوگرافی گازی - GC - مدل Agilent 7890 متصل شده با طیف سنج جرمی - Mass - مدل - Agilent 5975 - ستون-HP 5MSو نیمه قطبی به طول 30 متر، قطر داخلی ستون 0/25 میکرون، دتکتورMS ، گاز حامل هلیوم - - He ، سرعت جریان گاز حامل 1 میلیلیتر بر دقیقه، برنامه حرارتی 225 -60 درجه سانتیگراد با سرعت 4 درجه سانتیگراد بر دقیقه و دمای محفظه تزریق 270 درجه سانتی گراد - در مؤسسه دانش پژوهان تهران تجزیه شد . پس از تزریق اسانس به دستگاه¬های نامبرده، با استفاده از زمان بازداری ترکیب¬ها - - tR ، اندیس بازداری - RT - طیف جرمی و مقایسه این پارامتر¬ها با ترکیب¬های استاندارد و یا با اطلاعات موجود در کتابخانه نسبت به شناسایی ترکیب¬های تشکیل دهنده اسانس اقدام گردید. درصدکمّی این ترکیب¬ها نیز با محاسبه سطوح زیر منحنی در کروماتوگراف¬ها محاسبه شد ].8] آماده سازی باکتری لیستریا مونوسیتوژنز برای تلقیح :
سویه استاندارد و لیوفیلیزه باکتری Listeria monocytogenes PTCC 1163از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه شد. آمپولهای لیوفیلیزه باکتری ابتدا در شرایط استریل باز شد، سپس به محیط کشت مایع Tryptic Soy Broth - TSB - انتقال یافت و به مدت 48 ساعت در C°30 انکوبه شد. سپس محیط کشت حاوی باکتری به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ و مایع رویی با محلول رینگر جایگزین شد. به منظور جداسازی کامل محیط کشت از باکتریها محلول حاصل دوباره به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. تعداد باکتریها در مایع زیرین توسط روش کدورت سنجی در طول موج 570 نانومتر به دست آمد؛ به طوری که جذب نوری 0/08تا 0/1تقریباً معادل 1×108 باکتری در هر میلیلیتر در نظر گرفته شد. به منظور دستیابی به این محدوده جذب نوری، رقیق سازی با رینگر استریل انجام شد. بمنظور تأیید نتایج، شمارش باکتریایی به روش کشت سطحی روی محیط مولر هینتون آگار 24 - ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37درجه سانتی گراد - انجام پذیرفت. آماده سازی خمیر ماهی فیتوفاگ :
ابتدا 10 کیلوگرم ماهی فیتوفاگ - Hypophthalmichthys molitrix - از سطح مزارع پرورشی صید و داخل جعبه های حاوی یخ گذاشته شد. سپس به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی زابل منتقل شد و پس از شستشوی ماهیان عملیات پوست کنی انجام پذیرفت. سپس سطح زیرین گوشت بدون تماس با امعا و احشا برداشته و توسط چرخ گوشت دو بار چرخ شد. بعد از آن به نمونه های گوشت چرخ شده ماهی، CFU/g103×1باکتری تلقیح شد. نمونه های گوشت تلقیح شدهکاملاً هموژن شدند. از این گوشت تلقیح شده برای تهیه همه تیمارهای مورد آزمایش استفاده شد. تیماربندی و شمارش باکتری لیستریا مونوسیتوژن طی دوره نگهداری: تیمارهای شاهد، گوشت تلقیح شده اسانس نعناع فلفلی با غلظت های 1، 2و %v/w 4 در نظر گرفته شد.
همه تیمارها در کیسه های پلاستیکی بسته بندی و در طول دوره آزمایش در دمای یخچال نگهداری شدند. در طول دوره آزمایش، شمارش باکتری لیستریا مونوسیتوژن هر 48 ساعت انجام پذیرفت. به منظور شمارش لیستریا مونوسیتوژن از محیط انتخابی کشت CHROMagarکروموژنیک، شرکت میکروبیولوژی کروم آگار فرانسه - و مکمل آن - CHROMagar Listeria supplement - استفاده شد.[12] برای شمارش باکتری در هر بار زمان نمونه گیری، به 5 گرم گوشت چرخ شده ماهی مقدار 45میلی لیتر سرم فیزیولوژی اضافه و سپس هموژن شد. به منظور شمارش باکتریها، رقتهای سریالی - 1:10 - تهیه شد. 0/1 میلی لیتر نمونه TM Listeria رقیق شده را روی محیط کشت CHROMagar کشت سطحی داده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 گرمخانه گذاری شد. باکتری لیستریا مونوسیتوژنز روی این محیط، کلنی هایی به رنگ آبی با هاله سفید تشکیل داد .برای هر تیمار دو تکرار در نظر گرفته شد که پس از کشت پلیت های استاندارد، انتخاب و شمارش شدند. تجزیه و تحلیل آماری: آنالیز آماری دادهها با بهره گیری از نرم افزار SPSS17و توسط آزمونهای آماری کلموگروف- اسمیرنف و ANOVAیک طرفه و مقایسه میانگین ها نیز با آزمون دانکن انجام شد.
-3 نتایج و بحث: آنالیز اسانس
نتایج آنالیز ترکیب های اسانس نعناع فلفلی مورد استفاده در این مطالعه در جدول 1 نشان داده شده است. همانطور که در این جدول آمده است، ترکیب های اصلی تشکیل دهنده اسانس شامل منتول 42/96 - درصد - ، منتونن 18/43 - درصد - ، منتوفوران - 6/24 - ، منتیل استات 2/76 - درصد - ، نئو منتول 2/13 - درصد - ، لیمونن 1/09 - درصد - می باشد.
اثر ضد باکتریایی اسانس نعناع فلفلی
مطابق جدول شماره 2میانگین تعداد کلی باکتری لیستریا مونوسیتوژنز در گوشت چرخ شده ماهی فیتوفاگ در روز صفر 1×103 CFU بود. با گذشت زمان تعداد باکتری لیستریا مونوسیتوژنز در گروه شاهد افزایش یافت. در روز دوم نگهداری تعداد باکتری های تیمارهای تلقیح شده با نعناع فلفلی نسبت به گروه شاهد کاهش معنی داری داشت . - P<0/05 - نعناع فلفلی در سطح 4 درصد از روز اول تعداد باکتری لیستریا مونوسیتوژنز را به صفر رساند. نعناع فلفلی در سطح 1 و 2 درصد در روزهای پنجم به بعد اثر مهارکنندگی ضعیف و معنی داری را در برابر باکتری لیستریا از خود نشان داد . - P< 0/05 -
نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که اسانس نعناع فلفلی درروشها از محیط کشت و در برخی دیگر از مدلهای غذایی برای سطح 4 درصد - v/w - اثر مهارکنندگی و باکتری کشی قوی علیه بررسی اثرات ضد باکتریایی اسانس ها استفاده شده است .[1] لیستریا مونوسیتوژنز در گوشت چرخ شده ماهی فیتوفاگ دارد که کارمن و همکاران در سال - 2001 - که اثرات ضد میکروبی برخی از احتمالاً به دلیل منتول فراوان موجود در اسانس نعناع فلفلی است. گیاهان خانواده نعنائیان را روی برخی از باکتری های گرم مثبت و مطالعات در محیط آزمایشگاهی نشان می دهند که این ترکیب منفی مثل استافیلوکوک ارئوس، لیستریا منوسایتوژنز، اشرشیا کلی فنولی موجود در اسانس نعناع فلفلی فعالیت ضد لیستریایی دارند و سودوموناس بررسی کرده، آن ها علت احتمالی این اثرات را میزان .[16] بالای کارواکرول موجود در اسانس بیان کرده اند طبق نتایج این بطور کلی مقایسه نتایج بدست آمده در مورد خواص ضد باکتریایی مطالعه، غلظت1/2 درصدآویشن شیرازی اثر باکتری کشی قوی بر اسانسهای مختلف بسیار مشکل میباشد. از دلایل آن میتوان به باکتری اشرشیا کلی داشته است ولی اثر بازدارندگی پایینی بر رشد تفاوت در روشهای مختلف بررسی خواص ضد باکتریایی اسانسها، باکتری لیستریا منوسایتوژنز داشت .[12]
منابع تهیه آنها و سویه های باکتریایی بکار برده شده، روش عصاره محبوبی و حقی - 2008 - خواص ضدباکتریایی اسانس نعناع را به گیری، فاز رشد و میزان باکتری، نوع محیط کشت مورد استفاده، روش دیسک دیفیوژن و براث میکرودایلوشن مورد بررسی قرار دادندعوامل خارجی و داخلی مواد غذایی نظیر pH ، چربی، پروتئین، و حداقل غلظت مهار کنندگی آن را برای باکتری های گرم مثبت آب، آنتی اکسیدانها، مدت زمان و دمای گرمخانه گذاری، روش بین 0/25 - 4 //PO و برای لیستریا مونوسیتوژنز 1 //PO بسته بندی و ساختار فیزیکی مواد غذایی اشاره کرد. مدلهای گزارش نمودند .[14] مختلفی در مطالعات متعدد به منظور بررسی اثرات ضد باکتریایی و مونوز - Munoz - و همکاران در سال - 2009 - با مطالعه بروی نگهدارندگی اسانسهای گیاهی استفاده شده است. در برخی از این خواص ضد میکروبی عصاره مرزنجوش - Oregano - ، رزماری
