بخشی از مقاله
چکیده
بلوط ایرانی - Quercus brantiiL. - از خانواده راشییان - Fagaceae - از گونههای معرف منطقه رویشی زاگرس میباشد.یکی از روشهای حفظ و نگهداری و ازدیاد سریع گیاهان و درختان استفاده از روش کشت بافت میباشد. در تحقیق حاضر تکثیر غیرجنسی گونه بلوط ایرانی - Quercus brantii L. - از طریق کشت جوانهدر محیط کشت MS با هدف بهینه سازی آن به منظور تولید انبوه در بازه زمانی کوتاه مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور ابتدا جوانههای جانبی و انتهایی در تیرماه از مناطق رویش این گیاه در استان فارس جمعآوری گردید. بر روی نمونهها، تیمارهای سترونسازی و رفع مواد فنولی اعمال گردید. نتایج نشان داد تیمار ضدعفونی با استفاده از کلریدجیوه در غلظت 0/1 درصد به مدت 90 ثانیه از سایر تیمارها در رفع آلودگی مناسب تر بود. بهمنظور رفع مواد فنولی، غوطهوری ریز نمونهها در محلول حاوی 100 میلیگرم اسیدآسکوربیک در 100 میلی لیتر آب مقطر استریل بهترین نتیجه را به همراه داشت.
مقدمه
گونه بلوط ایرانی با نام علمی Quercus brantii L.متعلق به خانواده Fagaceae و جنس Quercus است که بهصورت درخت و درختچه در مناطق مختلف دنیا میروید - ازکان، . - 2006 فراوانترین گونه بلوط حاضر در جنگلهای زاگرس با نام بلوط ایرانی - Quercus brantii L. - شناخته میشود - نادری شهاب،. - 1391 روش معمول زادآوری از طریق بذر میباشد در زمانی که زادآوری جنسی با مشکل همراه باشد؛ میتوان از تکثیر غیرجنسی استفاده نمود - کنشلو، . - 1380 مهمترین عوامل مؤثر بر عدم زادآوری جنسی اینگونه در جنگلهای بلوط زاگرسموضوع تفرق صفات در تکثیر با بذر، چرای دام، آتشسوزی و جمعآوری بذر درختان برای تعلیف دام، مصارف خانگی و صنعتی، خشکی تابستانه و آفات و امراض بذرها و نهالها میباشد - حسینی و همکاران، . - 1387 به علاوه بذر بلوط در دسته بذرهای ریکلسیترانت بوده و به علت حساسیت به خشکی نگهداری طولانیمدت آن امکانپذیر نیست - موهان جانی و هاگمن، . - 2007
تولید انبوه گیاهانی عاری از بیماری در این نوع تکثیر یک منبع ذخیره گیاهی سالم محسوب میشود. انتخاب ریزنمونه از یک بخش سازماندهی شده اغلب جوانه در روند کشت بافت این ساختار سازماندهی شده را حفظ میکند - تاجی، . - 1382 انتخاب جوانه به دلیل اینکه ثبات ژنتیکی را بهتر از روش تکثیر از طریق اندام-زایی حفظ میکند برای تکثیر تجاری گیاهان سختچوب ارجحیت دارد - مک کون و مک کون، . - 1987 انتخاب پایه مادری مناسب در انتقال صفات مطلوب و درنهایت بهنژادی درختان بسیار حائز اهمیت میباشد - بونگا و ادرکاس، . - 1988 ریزنمونه انتخابی از عرصه طبیعت همراه با آلودگی زیاد میباشد و انتخاب نمونه از قسمتهای قوی مانند جوانهها، غدهها و ریشههای ذخیرهای و غیره احتمال آلودگی را کاهش میدهد - گوترت، . - 1959 در سترونسازی ریز نمونهها در شرایط کشت درون شیشهای موادی از قبیل هیپوکلریت کلسیم، هیپو کلریت سدیم، پراکسیدهیدروژن، الکل اتیلیک، کلرید جیوه، نیترات نقره و غیره با توجه به نوع گیاه و گونه موردبررسی در زمان و غلظتهای مختلف استفاده میگردد - خوشخوی و همکاران، . - 1386 روشهای بکار رفته در جنس بلوط متفاوت است.
در تحقیق زمانی و همکاران - 1391 - ،بر گونه بلندمازو از کلرید جیوه بهمنظور سترونسازی ریزنمونهها استفاده گردید. در تحقیق چالوپا 1984 - و - 1993 بهمنظور بررسی ریزازدیادی دو گونه Q.ruber و Q.petrea از محلول کلریدجیوه 0/1 تا 0/3 درصد برای مدت 2 الی 4 دقیقه استفاده شد. ازآنجاکه درمورد این گیاه انتشار فنول از همان ساعات اولیه در محیط کشت آغاز میشود؛ نیاز به چندین واکشت دارد که علاوه بر زمانبر بودن ساخت محیط کشت، هزینههای تولید را نیز بالا میبرد. قهوهای شدن بافت میتواند باکم کردن پتانسیل اکسیداسیونو احیاء با مواد احیاء کننده یا ضد اکسیدکنندهها، کاهش داده شود.
بافتها بیدرنگ پس از جدا شدن، در محلول ضد اکسیدکنندهها فرو برده میشوند. ازجمله ترکیباتی که بهعنوان ضد اکسیدکننده به کار میرود اسیدآسکوربیک و اسیدسیتریک میباشد. این دو جزء معمولترین ضداکسیدکنندهها میباشند - خوشخوی و همکاران، . - 1386 لذا این بررسی باهدف رفع موانع موجود در ریز ازدیادی شامل آلودگی، فنولی شدن، نکروزه شدن ریز نمونه گونه بلوط ایرانی انجام یافت.
روش تحقیق
تحقیق حاضر بهمنظور رفع موانع در مسیر ریز ازدیادی بلوط ایرانی صورت گرفت. در این بررسی از جوانههای رأسی استفاده شد. در تحقیقات جهت ریزازدیادی گونه Quercus rubur نشان داده شد که جوانه جمعآوریشده از رأس شاخههای انتهایی بهتر از ریز نمونههای تهیه شده از سایر بخشهای بلوط بودند - ورمیر و ایورس . - 1987 در ابتدای کشت نمونهها بسیار آلوده و همراه با تولید فنول شدید بود. آلودگیها اکثراً از نوع قارچی و باکتریایی بودند. بهمنظور رفع آلودگی از تیمارهای کلرید جیوه در دو غلظت 0/05 درصد و 0/1 درصد در زمانهای 30، 60، 90، 120 و 150 ثانیه استفاده شد. با روش مذکور کنترل آلودگی موفقیتآمیز بود اما ریز نمونهها به علت فنول شدید تا یک هفته پس از کشت نکروزه شده و از بین میرفتند.
لذا آزمایشی در قالب طرح بلوکهای کاملاً تصادفی طراحی شد و غلظتهای صفر - به عنوان شاهد - ، 25، 50، 75، 100، 125 و 150 میلیگرم اسیدآسکوربیک در 100 سیسی آب مقطر به عنوان آنتیاکسیدان مورد استفاده واقع شد. ریزنمونهها پس از جداسازی در محلول استریل حاوی اسیدآسکوربیک به مدت یک ساعت قرار گرفتند. قهوهای شدن تا حدودی رفع گردید. نتایج موجب شد در مراحل بعدی از اسیدآسکوربیک در چهار مرحله شستوشو استفاده شود.
در مرحله بعد 100 میلیگرم اسیدآسکوربیک ثابت در محلولهای ضدعفونی استفاده شد و دو غلظت %0/1 و %0/05 کلرید جیوه در چهار زمان 60، 90، 120 و 150 با 10 تکرار در قالب طرح بلوکهای کاملا تصادفی به صورت فاکتوریل مورد ارزیابی قرار گرفت. در تمام موارد از محیط کشت MS بدون هورمون استفاده گردید. pH محیط کشت در مراحل مختلف 5/7، غلظت آگار 5 گرم در لیتر و ساکارز 20 گرم در لیتر بود. ریز نمونهها پس از انتقال به مواد غذایی در شدت نور 3000 لوکس در 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند.
رطوبت در اتاقک رشد تقریباً 45 درصد بود و دما 25 درجه در طول روز و 27 درجه در شب تنظیم شد. جهت تجزیه و تحلیل آماری دادهها، پس از بررسی نرمال بودن توزیع دادهها اثر تیمارهای مختلف اعمال شده بر میزان زندهمانی ریزنمونهها توسط تجزیه و تحلیل واریانس بررسی شد سپس میانگینها با استفاده از آزمون دانکن گروهبندی گردید. کلیه تجزیه و تحلیلها با استفاده از نرمافزار SPSS انجام شد.
نتایج
در طول دوره کشت اولیه و استقرار عامل قهوهای شدن محیط کشت و نهایتاً قهوهای شدن ریز نمونه در اثر فعالیت پلی فنول اکسیداز به دلیل برش و قطع ریزنمونهها اتفاق افتاد. استفاده از اسیدآسکوربیک موجب کاهش و درنهایت حذف فنول گردید. با استفاده از غوطهورسازی ریز نمونه در محلول حاوی آنتیاکسیدان اسیدآسکوربیک تیمار بهینه انتخاب گردید. محلول حاوی 100 میلیگرم اسیدآسکوربیک نسبت به سایر غلظتهای این ماده تأثیر بسیار زیادی بر کاهش میزان فنولاکسیداز نشان داد. بیشترین درصد قهوهای شدن در تیمار شاهد یعنی بدون آنتیاکسیدان اتفاق افتاد. - جدول
پس از تعیین مناسبترین آنتیاکسیدان جهت سترونسازی، اثر غلظت کلرید جیوه و زمان بر میزان آلوده شدن ریزنمونهها در محلول همراه با یک قطره Tween 20 در100 میلیگرم اسیدآسکوربیک انجام شد. نتایج نشان داد که غلظت کلریدجیوه و زمان قرارگیری در آن همچنین اثر متقابل آنها بر زندهمانی ریز نمونهها تاثیر معنیدار داشت - جدول . - 2 نتایج مقایسات میانگین نیز نشان داد که استفاده از غلظت 0/1 درصد کلرید جیوه در زمان 90 ثانیه جهت ضدعفونی و رفع فنول اکسیداز بسیار مناسب میباشد و نسبت به سایر ترکیبات تیمارها بقای ریزنمونه بیشتری به همراه داشت .
- شکل . - 2اثر متقابل زمان و کلرید جیوه شکل -2 درصد زنده مانی ریزنمونههای بلوط ایرانی - Quercus brantii L. - تحت اثر زمان و غلظت کلریدجیوه در حضور اسید آسکوربیک T1، T2، T3، T4، غلظت 0/05 درصد کلرید جیوه به ترتیب در زمانهای 60، 90، 120 و 150 ثانیه و T5، T6، T7، T8، غلظت 0/1 درصد کلرید جیوه به ترتیب در زمان های60، 90، 120 و 150 میباشد.
نتیجه گیری
از مشکلات اساسی در تکثیر درختان تهیه ریز نمونه عاری از آلودگی است، زیرا ریزنمونه تهیه شده از عرصه طبیعت غالباً از آلودگی بالایی برخوردارند - دورزان و چالوپا، . - 1968 در تحقیق حاضر استفاده از کلرید جیوه %0/1 در زمان 90 ثانیه اثر مطلوبی بر زندهمانی ریزنمونهها داشت. مشابه آن در تحقیق بر گونه بلوط بلندمازو نشان داده شد که استفاده از کلریدجیوه %0/1 در زمان 2 دقیقه بیشترین میزان زندهمانی ریزنمونهها را به همراه داشت - زمانی و همکاران، . - 1391 کلریدجیوه ساقههای جانبی Sequoiadendron giganteum - بن و همکاران، - 1987 و ساقههای در حال رشد گونههای سختچوب متعددی - چالوپا، - 1987 را بهطورمؤثری ضدعفونی سطحی کرد.
همچنین کلریدجیوه در آلودگیزدایی نوک ساقههایPopulusمؤثرتر از هیپوکلریدسدیم یا پراکسیدهیدروژن بود - نوجوس و همکاران، . - 1987 کلرید جیوه 0/1 درصد در سترونسازی Eucalyptus occidentalis Endl. میزان آلودگی را بهطورمؤثری کاهش داد - آبروش و همکاران، . - 1391 استفاده از یک قطره Tween 20 در مورد گونه Eucalyptus globulus موجب نفوذپذیری بیشتر محلول سترونسازی گردید. - امام و عصاره، . - 1389
برش همانند سایر اعمال که باعث زخم میگردد آغازکننده تولید اکسیدازهای پلی فنولی است که سبب قهوهای شدن بافت میگردند - مارکس و سیمپسون، . - 1990 مشکل قهوهای شدن ریز نمونه از بافت گیاهان چوبی شدیدتر از گیاهان علفی است. برای جلوگیری از قهوهای شدن غالباً ریزنمونهها را پس از برش در تماس با آنتیاکسیدانها قرار میدهند - کامپتون و پریس، . - 1986 استفاده از اسیدآسکوربیک در این تحقیق بهعنوان یک آنتیاکسیدان اثر قابلتوجهی در کاهش مشکل قهوهای شدن داشت. همچنین غوطهور ساختن بافتهای Phoenix dactylifera قبل از ضدعفونی سطحی در محلول آنتیاکسیدان به مدت چند ساعت قهوهای شدن بافت را کاهش داد - زید و تیسرات، . - 1983 بر اساس نتایج بدست آمده در تحقیق حاضر مشخص شد که افزودن مواد سترونسازی مانند اسیدآسکوربیک و کلریدجیوه بیشتر از حد مشخصی باعث کاهش زندهمانی ریزنمونهها خواهد شد.
