بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی قارچهای اکتومایکوریزا در اکوسیستمهای مختلف از اهمیت خاصی برخوردار است. در این تحقیق شناسایی این قارچها به دو روش مولکولی و مورفولوژیکی انجام گردید که روش مولکولی تا حد زیادی دقیق تر میباشد. بدین منظور بازیدیوکارپ قارچها را از جنگل بلوط جمعآوری کرده و با روش مولکولی شناسایی نمودیم. بعد از شناسایی، اقدام به تولید مایه تلقیح و کشت قارچ در آزمایشگاه دانشگاه ایلام گردید سپس ریشههای نهالهای بلوط با این قارچها مایهزنی شدند.
بر اساس نتایج سه نوع قارچ اکتومایکوریزای Amanita crocea , Boletus comptus, Inocybe rimosa شناسایی شدند. همچنین اثر مایه-زنی قارچهای اکتومایکوریزا بر جذب فسفر در سطح یک درصد - 0.01 - توسط نهالهای بلوط معنیدار گردیدند. بهطور کلی استفاده از قارچهای اکتومایکوریزا جهت زندهمانی نهالهای درختان بلوط قویا توصیه میگردد.
مقدمه
اکتومایکوریزا یک رابطه همزیستی mutualistic بین ریشههای گیاهان عالی با قارچهای خاصی در خاک است که هر دو طرف در آن سود میبرند . - Itoo et al., 2013 - قارچهای اکتومایکوریزا 1 در سراسر جهان شامل 343 جنس و 11950 گونه بوده که 252 جنس متعلق به رده بازیدیومایکوتا، 84 جنس متعلق به آسکومایکوتا و 5 جنس متعلق به زیگومایکوتا میباشد . - Rinaldi et al., 2008 - مطالعات نشان دادهاند که مایکوریزا میتواند تحمل گیاهان را به تنشهای محیطی افزایش دهد و به بقا و رشد یک گیاه کمک کند
اکتومایکوریزاها تقریبا همیشه دارای یک شبکه هارتیگ متشکل از هیفهای بسیار هستند که به طور کامل سلولهای بیرونی پوست ریشه را احاطه کرده است. در خارج از ریشه این هیفهای قارچی به شکل یک غلاف تجمع پیدا میکنند که - mantle - نامیده میشود که از هیفهای بین سلولهای پوستی منشا میگیرد . شبکه هارتیگ محل عظیمی برای انجام مبادلات دو طرفه مواد غذایی بین میزبان و قارچ میباشد در حالی که میزبان مقدار قابل توجهی از مواد فتوسنتز خود را در اختیار قارچ قرار میدهد
شریکهای قارچی تقریبا تمام متابولیسم آنها را انجام میدهند و باعث رشد و شکلگیری قارچها میشوند و قارچها مواد غذای ضروری مانند P, N و K را در اختیار میزبان خود قرار میدهند
قارچهای ECM از طریق افزایش جذب و حرکت عناصر غذایی برای درختان میزبان همزیست خود مفید هستند. این قارچها با انحلال ذرات معدنی خاک مانند آپاتیت، فلدسپار، میکا و هورنبلند، عناصر غذایی و یونهای معدنی مانند - - K+ , Fe3+ , Ca 2+ ,Mg2+, PO43- را از خاک به دست میآورند . - Landeweert et al., 2001 - بیشترین مقدار فسفر کل در خاکهای جنگلی در مولکولهای پیچیده مانند اینوزیتول فسفات، نوکلئوتیدها و فسفولیپیدها وجود دارد
یونهای اورتوفسفات تنها شکل از فسفر هستند که به وسیله میکروارگانیزمها و گیاهان جذب میشود. که به عنوان نتیجه فعالیتهای فسفات در محلول خاک آزاد میشود . - Rao et al., 1996 - این مطالعات فرضیه نقش فعال و اهمیت زیست محیطی هیفهای قارچهای اکتومایکوریزا در جذب فسفر تحت شرایط کمبود فسفر را حمایت میکنند. بلوط - Quercus - نام یک جنس غالب از گیاهان در مناطق شمالی و مرکزی ایران است و از بسیاری از گونهها تشکیل شده است. بلوطی که در مناطق جنگلی مرکزی ایران میروید یکی از مهم ترین جنسهای این گیاه با 45 گونه است. گونه غالب آن Quercus brantii میباشد
با توجه به اهمیت همزیستی قارچهای اکتومایکوریزا با درخت بلوط و اینکه تاکنون در زمینه شناسایی و کشت این قارچها در ایران مطالعات بسیار اندکی انجام شده است. هدف از انجام این تحقیق کشت قارچهای اکتومایکوریزا در شرایط آزمایشگاهی برای اولین بار در کشور و فرآیند مایهزنی این قارچها به نهالهای بلوط در شرایط کشت در خاک استریل انجام گردید و در مرحله آخر جذب فسفر از اندام برگ اندازه گیری شد.
مواد و روشها منطقه مورد مطالعه
این مطالعه در جنگل بیوره به مختصات جغرافیایی 33 درجه و 19 دقیقه و 28 ثانیه عرضی و طول 46 درجه و 41 دقیقه و 23 ثانیه و 1679 متر ارتفاع از سطح دریا، واقع در استان ایلام در اردیبهشت 95 انجام شد. مساحت کل جنگلهای بیوره 4417 هکتار است. پوشش غالب آن درختان بلوط است. متوسط بارش سالانه 521/5 میلیمتر است و میانگین سالانه دما 19/4 درجه سانتیگراد است. اقلیم منطقه نیمه مرطوب میباشد. بازیدیوکارپ2 قارچها با فاصله 2-3 متر از تنه درختان جمع آوری شدند.
استخراج DNA از بازیدیوکارپها
استخراج DNA از حدود 5 میلیگرم از بازیدیوکارپ بر اساس دستورالعمل - Doyle and Doyle, 1990 - با کمی تغییرات انجام شد. نمونهها در ازت مایع با استفاده از یک هاون چینی خورد شدند. سپس به هر کدام از آنها 700 میلی لیتر بافر استخراج Tris-HCl - ، EDTA، NaCI و %2 CTAB و مرکاپتواتانول - %2 3 اضافه و به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 65 درجه سانتی گراد قرار گرفت. سپس 700 میکرولیتر کلروفورم/ایزوآمیل الکل به نسبت حجمی 1/24اضافه شد. 20دقیقه در سانتریفیوژ دو فاز از هم جدا میشوند مایع رویی را جدا کرده سپس 2 میکرولیتر RNase به هر ویال اضافه کرده و دوباره برای 30 دقیقه در درجه حرارت 37 درجه قرار گرفت.
به هر کدام از ویالها 70میکرولیتر سدیم استات 2/5 مولار یا - پتاسیم استات - اضافه گردید. سپس 400 میکرولیتر ایزوپروپانول اضافه و در دمای -20 به مدت 30دقیقه تا 24 ساعت نگهداری می-شود. بعد از این مرحله در طی سانتریفیوژ در 10 دقیقه DNA به صورت پلیت در ته ویال قرار میگیرد فاز رویی را ریخته با اتانول %70 شستشو داده و سانتریفیوژ به مدت 1 دقیقه دوباره پلیت تشکیل میشود اتانول را ریخته و ویال در دمای اتاق به مدت چند ساعت خشک میشود.
100 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه کرده و در دمای 4 درجه به مدت 24 ساعت قرار میدهیم و در پایان ویالها را در -20 نگه میداریم. کیفیت DNA استخراج شده با ژل آگاروز 0/8 درصد و الکتروفورز و رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید مشخص شد. پرایمرهای مورد استفاده عبارتند از - White et al., 1990 - - ITS1/1TS4 - در یک ویال استریل 4 میکرولیتر از محلول DNA، 1 میکرولیتر پرایمر Forward، 1 میکرولیتر پرایمر Reverse، 12/5 میکرولیتر Master Mix و 6/5 میکرولیتر آب مقطر استریل ریخته سپس ویالها را در دستگاه PCR با دمای آنالینگ 54/3 قرا میدهیم. کیفیت باندها با ژل آگاروز 1درصد و الکتروفورز و رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید مشخص شد و به وسیله دستگاه ژل داک و نور ماوراء بنفش عکسبرداری شد و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. پس از استخراج DNA و تکثیر از منطقه ITS تعیین توالی توسط شرکت Macrogen کره انجام شد.
کاشت و نگهداری نهالهای بلوط - Quercus brantii - و مایه زنی ریشهها
جهت انجام آزمایش گلدانها با مخلوط سترون حاوی نسبت مساوی خاک جنگلی، خاک برگ و شن پر شد. نهالهای یکساله بلوط در این گلدانها کشت شدند. در صورت نیاز به آب، آبیاری هر واحد آزمایشی جداگانه انجام گردید. کشت قارچها در محیط کشت جامد MS - Murashige and skoog, 1962 - انجام شد. اینوکلوم قارچ تهیه گردید. سپس مایه زنی قارچ اکتومایکوریزا به اطراف ریشه نهالهای بلوط صورت گرفت. نهالها به مدت 7 ماه در شرایط محیطی آزاد نگهداری شدند.
به منظور اندازهگیری جذب فسفر برگ نهالها را جدا کرده سپس در آون جهت رسیدن به وزن ثابت به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سانتی گراد خشک و به صورت پودر در آورده شدند. جهت انجام عمل هضم از مخلوط اسیدها 18 - میلی لیتر آب مقطر، 100 میلی لیتر اسید سولفوریک و 6 گرم اسید سالیسیلیک - استفاده کردیم. اندازهگیری فسفر به روش کالریمتری - رنگ زرد مولیبدات وانادات - صورت گرفت. و به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج 470 نانومتر خوانده شد.
طرح آزمایشی
بهمنظور بررسی تأثیر مایه زنی قارچ اکتومایکوریزا بر جذب فسفر و رشد نهالهای بلوط، آزمایشی در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تیمار آزمایشی شامل الف- سه نوع قارچ اکتومایکوریزا شامل Amanita crocea, Boletus comptus, Inocybe rimosa و ب- تیمار شاهد - بدون تلقیح قارچ - در سه تکرار انجام شد.
نتایج و بحث
جدول -1 نتایج شناسایی مولکولی قارچها تا مرحله جنس و گونه
نتایج بدست آمده از نرم افزار Blast n توالیهای که بیشترین درصد شباهت با توالی مورد نظر ما و هم چنین کم ترین مقدار E value را داشته باشند را نمایش می دهد. E value صفر ایده آل ترین حالت ممکن است و در غیر این صورت هر چه به صفر نزدیک تر باشد اطمینان ما به نتایج به دست آمده بیشتر میشود. بنابراین توالیهای که بر اساس این دو شاخص مشخص می شوند توالی هایی هستند که اطمینان ما در شباهت آنها به توالی الگوی مورد نظرمان بیشتر است.
با استفاده از نرم افزار Blast و مقایسه توالیهای بدست آمده با تمام توالیهای بانک ژنی، قارچهای اکتومایکوریزا تا مرحله جنس و گونه شناسایی شدند. هم چنین توالیهای بدست آمده در بانک ژن ثبت شدند که در جدول 1 با شماره دسترسی - Accession - مشخص شده است. قارچهای شناسایی شده عبارتند از: Inocybe rimosa , Amanita crocea, Boletus comptus که از شاخه بازیدیومایکوتا میباشند. شکل های 1-3 مشخصات مورفولوژیکی این قارچها را نشان میدهد.
