بخشی از مقاله
چکیده
عسل مادهای غنی از فنولیک اسیدها و فلاونوئیدهاست که اثرات بیولوژیکی گستردهای را نشان میدهد و به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی عمل می- کند. آنالیز پلی فنولها به عنوان راهی برای مطالعهی منشأ گیاهی و جغرافیایی عسل در نظر گرفته میشود. این مطالعه به بررسی مطالعات اخیر در تعیین این ترکیبات فعال در عسل میپردازد. فرآیند آنالیز برای تعیین ترکیبات فنولیک به صورت جداگانه شامل استخراج ازنمونه ماتریس، جداسازی تجزیهای و تعیین کمی است. در این بررسی روشهای پیش تیمار نمونه و جداسازی - مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و الکتروفورز - مورد توجه خاص قرار گرفتهاند.
مقدمه
ترکیبات فنولیک یا پلی فنولها یکی از مهمترین گروه از ترکیبات موجود در گیاهان هستند که به صورت گستردهای درآنها توزیع شدهاند. پلی فنول-ها همچنین محصولات ثانویهی متابولیسم گیاهان هستند. فلاونوئیدها و فنولیک اسیدها - مشتقات بنزوییک اسید و سینامیک اسید - مهمترین دسته از پلی فنولها را تشکیل میدهند.
فلاونوئیدهای رژیم غذایی را میتوان به فلاوانولها، فلاوانونها، فلاونها، آنتوسیانیدینها و ایزوفلاونها دسته بندی کرد. این ترکیبات اثرات بیولوژیکی گستردهای شامل فعالیتهای آنتی باکتریایی، ضد التهابی، ضد حساسیت و آنتی ترومبوز از خود نشان میدهند - . - 1 مطالعات اپیدمیولوژیک به نقش احتمالی آنها در پیشگیری از بیماریهای قلبی عروقی و سرطان اشاره دارد. فلاونوئیدها به طرق مختلف میتوانند به عنوان آنتی اکسیدان عمل می-کنند که شامل به دام انداختن مستقیم اکسیژن فعال، مهار آنزیمهای مسئول تولید آنیونهای سوپراکسید، شلاته کردن فلزات درگیر در فرآیندهای تولید رادیکالها و پیشگیری از واکنشهای پراکسیداسیون از طریق کاهش رادیکالهای آلکوکسیل و پراکسیل است.
عسل یک مادهی غذایی طبیعی و شناخته شده از نظر ارزش غذایی و دارویی است. مصریان و یونانیان باستان از عسل به عنوان دارویی برای درمان بیماریها - مانند زخم معده و زخمهای پوستی - استفاده میکردند. آپی تراپی - استفاده دارویی از محصولات زنبور عسل - اخیراً به طبی پیشگیرانه برای درمان برخی بیماریها و ترویج سلامتی عمومی تبدیل شده است
به علت شیرینی، رنگ و عطر و طعم عسل، این ماده اغلب به عنوان جایگزین شکر و به عنوان یک ماده نگهدارنده در بسیاری از مواد غذایی تولیدی استفاده میشود. عسل باعث جلوگیری از واکنش اکسیداسیون در غذا میشود - برای مثال اکسیداسیون چربی در گوشت و قهوهای شدن آنزیمی میوهها و سبزیجات - . از دیدگاه شیمیایی عسل یک محلول بسیار غلیظ شده و پیچیدهای است که ترکیب آن شدیداً به گونهی گیاهی که از آن شهد جمع آوری میشود و عوامل دیگر مانند شرایط محیطی و آب و هوا بستگی دارد. علاوه بر قندها عسل دارای رنج وسیعی از ترکیبات جزئی شامل پلی فنولهاست که خواص آنتی اکسیدانی آنها شناخته شده است. سنجش قابلیت جذب رادیکالهای اکسیژن نشان میدهد که عسل از نظر قابلیت آنتی اکسیدانی مانند بسیاری از میوهها و سبزیجات تازه است - . - 3 عسل با رنگ تیره محتوای فنولیک کل بالاتر و در نتیجه قابلیت آنتی اکسیدانی بالاتری دارد
آنالیز ترکیبات فنولیک روشی برای مطالعهی منشأ عسل نیز هست. برای مثال هسپرتین شاخصی برای عسل مرکبات، کامپفرول شاخصی برای عسل رزماری و کوئرستین شاخصی برای عسل گل آفتابگردان محسوب میشوند - . - 5 بعضی از فنولیک اسیدها نیز به عنوان شاخص گل مورد استفاده قرار میگیرند. منشأ گیاهی عسل یکی از پارامترهای اصلی کیفیت و قیمیت آن است. آنالیز ترکیبات فرار در عسل علاوه بر محتوای مواد معدنی آن میتواند ابزار مناسبی برای بیان مشخصات منشأگیاهی و جغرافیایی آن باشد.
به طور کلی فرآیند تجزیهای برای تعیین ترکیبات فنولیک به طور جداگانه شامل گامهای اساسی جداسازی از ماتریس نمونه، جداسازی تجزیهای و شناسایی و تعیین مقدار آن است. مرحله بازیابی معمولاً شامل استخراج فاز جامد - SPE - یا استخراج با حلال با استفاده از رنج وسیعی از حلالهاست. جداسازی معمولاً با استفاده از کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا - HPLC - یا الکتروفورز مویین - EC - انجام میشود گرچه کروماتوگرافی گازی - GC - نیز در بعضی نمونهها استفاده میشود.
متداولترین حالت جداسازی استفاده از سیستمهای فاز معکوس - RP - است که معمولاً با یک ستون C18 و فازهای متحرک مختلف انجام میشود. تشخیص با استفاده از جذب UV اغلب شامل یک دتکتور فتودیود و روشهای طیف جرمی متفاوت انجام می- شود. در این مقاله فرآیندهای تجزیه ای که امکان تعیین فنولیک اسیدها و فلاونوئیدها در عسل را به صورت جداگانه یا به صورت یک گروه به طور همزمان فراهم میآورد ارائه خواهد شد و در مورد فواید و مضرات آنها بحث خواهیم کرد.
مواد و روش ها
-1 آماده سازی نمونههای عسل
به طور معمول فرآیند شامل نمونه گیری به صورتی است که نمونه تهیه شده نمایندهی خوبی از کل نمونه باشد. همگن سازی، استخراج، حذف ماتریس و پیش تغلیظ - در صورت نیاز - قبل از آنالیز نهایی است. برای نسبتهای کوچک نمونه همگن بودن مواد خام اهمیت دارد و ممکن است منجر به تناقض بزرگ در نتایج شود خصوصاً وقتی که تعداد بیشتری از نمونههای فرعی از مادهی یکسان مورد آنالیز قرار میگیرند.
-1-1 استخراج هدف نهایی آماده سازی عصاره نمونه به صورت یکنواخت این است که همه ترکیبات ماده در نمونه انتخاب شده حضور داشته باشند
به طور کلی برای آنالیز فنولیک اسیدها و فلاونولها در عسل قندها باید حذف شوند. جدا از حذف ترکیبات ماتریس آنالیتها باید جداسازی و تغلیظ شوند. در مورد استخراج مایع- مایع - LLE - ، حلال معمولاً اتیل استات یا اتانول است. در LLEمعمولاً آگلیکونها جدا میشوند در حالی که در بقیه روشها - مانند استخراج به همراه هیدرولیز در دمای بالا - هدف میتواند هر دوی آگلیکونها و کانژوگه ها باشد.
در سالهای اخیر روشهای جدیدی برای استخراج فلاونوئیدها به وجود آمده است - برای مثال استخراج با کمک ماکروویو - MAE - ، استخراج التراسونیک . - - UE - نتایج تجربی نشان میدهد که زمان استخراج به صورت چشمگیری کاهش مییابد و بازده فلاونوئیدها به طور موثری بهبود مییابد. اما سلکتیویتی MAE کم بود. زمانهای طولانیتر پرتو افکنی در UE منجر به کاهش درصد ترکیبات استخراج شده میشودکه احتمالاً به علت فرآیندهای تجزیهای است.
روشهای استخراج متناوب - مانند استخراج با سیال فوق بحرانی - SFE - و استخراج با مایع تحت فشار - - PLE - به علت زمان استخراج کوتاهتر و مصرف کمتر حلال برای جداسازی پلی فنولیک اسیدها و فلاونوئیدها محبوبیت بیشتری دارد. به علت خاصیت غیر قطبی CO2 در SFE باید برای بالا بردن راندمان استخراج، مقادیر قابل توجهی اصلاح کنندههای آلی قطبی اضافه شوند اما این باعث کاهش سلکتیویتی میشود. بر اساس نتایج تحقیقات Tomás-Barberán و همکاران - - 8، آمبرلیت XAD-2 ترکیبات فنولیک عسل را 80-%90 جذب میکند.
به طور کلی نمونههای عسل با 5 قسمت از آب اسیدی شده با HCL تا 2 PH مخلوط شدند و برای حذف ذرات جامد از بین پنبه فیلتر شدند. سپس ماده فیلتر شده از ستونی حاوی آمبرلیت XAD-2 عبور کرد. ترکیبات فنولیک روی ستون باقی ماندند در حالی که قندها و دیگر ترکیبات قطبی با آب اسیدی شده شسته شدند. بخشهای فنولیک با استفاده از متانول جدا شدند و در دمای 400C در خلا خشک شدند. در بعضی نمونهها ماده فیلتر شده با ذرات آمبرلیت مخلوط شد و در یک همزن مغناطیسی به مدت 10 دقیقه قبل از پر کردن ستون همزده شد. برای مرحله خالص سازی بقایای به دست آمده از تبخیر متانول دوباره در آب مقطر حل شدند و با دی اتیل اتر استخراج شدند، سپس حلال با استفاده از گر گرفتگی با نیتروزن حذف شد. سپس بقایا ی خشک شده با متانول حل شدند و از غشای 0/45 ʽm فیلتر شدند و برای آنالیز HPLC آماده شدند
کارتریج های SPE C18 نیز برای بازیابی ترکیبات فنولی از عسل استفاده میشوند - 11، . - 10 نمونههای عسل در معرض هیدرولیز اساسی قرار گرفتند و با اتیل استات استخراج شدند - . - 10 عصاره خشک در آب یونیزه شده اسیدی شده - PH= 3/5 - حل شد و ترکیبات فنولیک روی ستونهای C18 ایزولوت جذب شدند. آنالیتها با عبور محلول %25 - حجمی/حجمی - متانول-آب شسته شدند. Dimitrova و همکاران - - 11 جداسازی SPE غنی سازی فنولیک اسیدها را روی کارتریج C18 باند الوت با استفاده از سیستمهای شستشوی استونیتریل-تتراهیدروفوران با نسبت حجمی 1 به 1 پیشنهاد کردند.
برای تعیین هدف جداسازی ترکیبات پلی فنولیک از عسل عملکرد چندین کارتریج پوشش داده شده با مواد جاذب C18 - باند الوت و پلی متریک Strata، Oasis HLB و آمبرلیت - XAD-2 مورد مقایسه قرار گرفتند - . - 12 سیلیکای C18 برای بازیابی ترکیبات آزمایش شده مناسب نبود. اما بعضی از پلی فنولها - مانند کوئرستین - بازیابی بیش از %90 را نشان دادند.
عملکرد بهتر جاذبهای پلی متریک در مقایسه با C18 را میتوان به ساختار آروماتیک آنها نسبت داد که میتوانند ترکیبات فنولیک آروماتیک را جذب کنند. کامپفرول، -pکوماریک اسید و سیرنجیک اسید روی آمبرلیت XAD-2 به طور کامل جذب شدند اما بازیابی کوئرستین با متانول فقط %54 بود. با افزایش مقدار جاذب Oasis HLB تا 2/5 گرم بازیابی در حدود %80 داشت
-2-1 هیدرولیز
اگر آنالیتهای هدف آگلیکونها باشند، هیدرولیز شیمیایی معمولاً با هیدروکلریک اسید یا فرمیک اسید در دماهای بالا - 80-1000 C - انجام می-شود - . - 6 کارایی بازیابی بستگی به غلظت اسید، زمان و دمای هیدرولیز دارد. در بیشتر مقالات هیدرولیز آگلیکونهای فلاونوئیدها از میوه ها و سبزیجات در 1/2 mol/l هیدروکلریک اسید در دمای 900C به مدت 2 ساعت انجام شده است - . - 13 اما افزایش زمان در معرض هیدروکلریک اسید قرار گرفتن می تواند باعث تجزیه بعضی فلاونوئیدها - مانند کوئرستین - - 14 - شود.
به طور کلی برای فرآیند هیدرولیز بهترین شرایط آزاد شدن کامل آگلیکونها و به حداقل رساندن واکنشهای تجزیهای ترکیبات درگیر در واکنش است.
-2 آنالیز کروماتوگرافی و الکتروفورز از پلی فنولهای موجود در عسل
به طور کلی جداسازی فنولیک اسیدها و فلاونوئیدها توسط HPLC مجهز به ستون RP انجام میشود که معمولاً با ذرات کروی سیلیکای باند شده با زنجیرههای اکتادسیل C18 پوشش داده شده است. ستونهای HPLC پوشیده شده با ساپورتهای مونولیتیک شامل قطعهای یکپارچه از مواد متخلخل، جداسازی سریع تناوبی را امکان پذیر میسازد. مزیت اصلی این ساپورت خاصیت هیدرودینامیک عالی آن است که امکان کاهش فشار پشت و افزایش سرعت جریان را فراهم میسازد. ستونهای مونولیتیک در آنالیزهای فیتوکمیکال به طور فزایندهای مورد استفاده قرار میگیرند. اما در زمینه آنالیز مواد غذایی فقط برای تعیین ترکیبات فنولیک در شراب و فنولیک اسیدها در میوهها - - 15 مورد استفاده قرار گرفته اند.
فازهای متحرک گوناگونی به کار گرفته میشوند اما سیستمهای دوتایی شامل یک ترکیب آبکی و حلال آلی با قطبیت کمتر - برای مثال استونیتریل یا متانول - متداول هستند. اسیدها - برای مثال فرمیک، استیک یا فسفریک - معمولاً به منظور حفظ PH مناسب به آن اضافه میشوند. شستشوی ایزوکراتیک برای آنالیز فنولیک اسیدها در عسل درخت توتهب کار گرفته شد. الگوی شستشو معمولاً به صورت بنزوئیک اسید، سینامینیک اسید، فلاون گلیکوزید است که با گلیکوزیدهای فلاوانول و فلاونها سپس آگلیکونهای آزاد ادامه پیدا میکند.
در LC با عملکرد فوق العاده - UPLC - که در آن از ذرات 1/5- 2 ʽm ، ستونهای تجزیهای باریک و تجهیزاتی که در فشارهای بالاتر از آن چه در HPLC است استفاده میشود. در تفکیک پذیری، حساسیت و سرعت آنالیز افزایش چشمگیری مشاهده میشود همچنین جداسازی روی -HPLC RP که 20 دقیقه طول میکشد، میتواند در زیر 3 دقیقه در UPLC انجام شود. این روش جدید کروماتوگرافی تا به حال برای جداسازی و تعیین کمی پلی فنولهای اصلی شکلات مورد استفاده قرار گرفته است
تلاشهای زیادی برای ارتباط دادن ساختار فلاونوئیدها به ابقا کروماتوگرافیک آنها با استفاده از پارامترهای مختلف برای توصیف ساختار انجام شده است - Stefanova . - 17 و همکاران - 17 - روشی را پیشنهاد کردند که بر اساس آن اثرات جایگزینها نیز در نظر گرفته میشود. اثر دو جایگزین مختلف OH - و - OCH3 در 8 جایگاه ممکن در حلقه فلاون روی بقای RP-HPLC در گروه 21 فلاونها مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج به دست آمده برای ارزیابی ساختار یک ترکیب ناشناخته در عصاره متانولیک استفاده شد و الگوی پیشنهاد شده از جایگزینها توسط اسپکترومتری جرمی و رزونانس مغناطیس هستهای فلاونهای جداشده تأیید شد.
GC نیز برای آنالیز پلی فنولها خصوصاً فنولیک اسیدها در عسل مورد استفاده قرار گرفت. اما این روش مناسبترین روش نیست زیرا اکثریت این ترکیبات فرار نیستند بنابراین مرحله مشتق سازی ضروری است و اغلب مشتقات متیله شده یا تری متیل سیلیل مورد استفاده قرار میگیرند. اگرچه HPLC عمدهترین روش جداسازی برای ترکیبات پلی فنولیک است، اما CE محبوبیت بیشتری دارد و روشی تناوبی برای آنالیز مواد گیاهی ارائه میدهد. حالتهای CEکه عمدتاً برای این منظور استفاده میشود، الکتروفورز ناحیه موئین - 18 - - CZE - و کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی - MEKC - است.
برای دستیابی به ترکیبات گروه هیدروکسی - به عنوان اسیدهای نسبتاً ضعیف - جداسازی را با CZE، الکترولیت در زمینه بورات یا استات در 9 PH تا 10 انجام میدهند.CZE اغلب برای آنالیتهای شارژ شده استفاده میشود. در MEKC در حضور سورفکتانت - برای مثال سدیم دودسیل سولفات - - SDS - ، جداسازی بر اساس هیدروفوبیسیتی است که توزیع آنالیت را بین فاز آبی و فاز میسلی تحت تأثیر قرار میدهد. ترکیبات مانند فلاونوئیدها به شدت با میسلها واکنش میدهند و در نتیجه به صورت انتخابی با تغییر فاز میسلی ممکن است متفاوت باشند. استفاده از شلاته کننده سدیم در ترکیب با SDS به علت نوع و خواص میسل جالب است
