بخشی از مقاله
چکیده:
اغلب روش هاي متداول اندازه گیري اسید فولیک به علت هزینه بر و زمان بر بودن و قرار گرفتن تحت تأثیر عوامل مداخله گر داراي محدویت هایی هستند. در این مطالعه از یک حسگر بر پایه اسیدهاي نوکلئیک براي اندازهگیري اسیدفولیک استفاده شده است.
در ابتدارشتههاي داکسی ریبونوکلئیک اسید - DNA - به دست آمده از اسپرم ماهی سالمون روي سطح الکترود مغزمداد تثبیت گردید. سپس شرایط تثبیت بهینهسازي شد و بهترین نتایج در شرایط pH معادل 4/8 ، غلظت داکسی ریبونوکلئیک اسید ppm 24، پتانسیل تثبیت 0/7ولت و زمان اعمال پتانسیل معادل 304 ثانیه به دست آمد که با استفاده از این متغیرها، پیام جریان 3/04 میکروآمپر ایجاد شد. با استفاده از این زیستحسگر، جریان در دامنه غلظت اسیدفولیک 1 تا 10 میکرومول از رابطه خطی تبعیت می کرد و حدتشخیص حسگر در این دامنه 1/06*10-8 به دست آمد. در نهایت این حسگر براي اندازهگیري اسیدفولیک در نمونههاي واقعی مانند قرص اسیدفولیک، آرد گندم و اسفناج مورد استفاده قرار گرفت.
مقدمه
کمبود اسیدفولیک با شیوع نقص در لوله عصبی نوزادان [3]، بیماري هاي قلبی و عروقی، سرطان روده بزرگ و کم خونی [5] در رابطه است. اغلب روش هاي متداول اندازه گیري اسید فولیک به علت هزینه بر و زمان بر بودن و قرار گرفتن تحت تأثیر عوامل مداخله گر داراي محدویت هایی هستند.
روش هاي الکتروشیمیایی، روش هاي ساده و ارزانی هستند که به مقادیر بسیار کمی نمونه براي تجزیه نیاز دارند.[2] تا کنون مطالعاتی درباره اندازه گیري اسید فولیک توسط روش هاي الکتروشیمیایی انجام شده که برخی از آن ها فاقد حساسیت بالا و یا در بسیاري موارد فاقد انتخابگري مناسب هستند. تاکنون اسید فولیک به روش هاي مختلفی به صورت الکتروشیمیایی اندازه گیري شده است که بعضاً دقت کافی نداشته و گاهی اختصاصی نبوده است که در زیر به برخی از آنها اشاره می شود.
ابوالمعالی در سال 1992 از الکترود خمیر کربن اصلاح شده با پالمتیک و استئاریک به منظور اندازه گیري اسید فولیک استفاده کرد که حدتشخیص آن 10 -8بود .[1] سپس وان و یانگ در سال 2002 استفاده از الکترود طلاي اصلاح شده با مرکاپتوبنزوتیازول را بررسی کردند که حد تشخیص آن 4×10 -9 بهدست آمد
در سال 2005 وانگ و همکاران حسگري طراحی کردند که بر پایه الکترود کربن شیشهاي اصلاح شده با نانولوله هاي کربنی تک دیواره عمل میکرد که پس از 5 دقیقه تجمع، به حد تشخیص 10 -9 میرسید .[8] سال بعد الکترودي پوشیده شده از فسفومولیبدیک و پلی پیرول توسط گو و همکاران بررسی شد [4] و در سال 2008 جیانگ و همکاران از الکترود کربن شیشه اي اصلاح شده با نانولوله هاي کربنی چند دیواره استفاده کردند .[5] زیست حسگرها داراي انتخابگري بالاتري نسبت به سایر حسگرها هستند.
در این مطالعه از یک حسگر بر پایه اسیدهاي نوکلئیک براي اندازهگیري اسیدفولیک استفاده شده است.
مواد و روش ها
الکترود تمیز شده، تحت پتانسیل مناسب داخل بافر استات - pH=4.8 - در پتانسیل 1/8 ولت نسبت به الکترود مرجع نقره/کلرور نقره فعال سازي میشود. الکترود فعال سازي شده داخل بافر استات حاوي مقادیر مختلف داکسی ریبونوکلئیک اسید قرار داده شده، اختلافپتانسیل 0/5 ولت نسبت به الکترود مرجع نقره/کلرور نقره به مدت زمان مناسب اعمال میشود. الکترود تعدیل شده را پس از 5 ثانیه شست وشو، در داخل بافر استات قرار داده و دامنه پتانسیل از 0/4 تا 1/4 با دامنه پالس و سرعت روبش مناسب اعمال میشود. به این ترتیب پیکهاي مربوط به اکسایش آدنین و گوانین به دست میآید. براي بررسی تقابل داکسی ریبونوکلئیک اسید و ماده مورد نظر، الکترود تعدیل شده با داکسیریبونوکلئیکاسید را به مدت 90 ثانیه در محلول بافر استات حاوي مقادیر مختلف ماده مورد نظر قرار داده، سپس الکترود را شست وشو داده و در داخل بافر استات تحت پتانسیل 0/4 تا 1/4 با دامنه پالس و سرعت روبش مناسب قرار داده میشود. محلولهاي مختلف با غلظتهاي متفاوت در رنج1 ×10-9 مولار تا 1 ×10-3 از اسیدفولیک در سود 0/1 نرمال تهیه شد و به بافر تریس افزوده گردید و بهمدت 7 دقیقه هم زده شده تا با داکسی ریبونوکلئیک اسید نشسته بر روي سطح الکترود واکنش دهد، سپس میزان کاهش پیام جریان مربوط به باز آلی آدنین مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی اثر مزاحمتها، غلظتهاي مختلف مواد مختلف موجود در نمونه واقعی مانند اسید آسکوربیک، تیامین، ریبوفلاوین، پیرودوکسین، نیکوتین آمید، گلوکز، ساکارز،Ca2+ وFe2 + روي پاسخ زیستحسگر نسبت به غلظت 1 ×10-6 از اسیدفولیک مورد بررسی قرار گرفت. براي تهیه عصاره اسیدفولیک از 3 نمونه قرص، آرد گندم غنیسازي شده و اسفناج استفاده شد.
نتایج و بحث
تمام سطح جانبی در تماس با محلول مغزمدادهاي داراي طول یکسان با نوار تفلون پوشانده شده، سپس سطح مقطع در تماس با محلول روي کاغذ سنباده سایش داده شده و با آب مقطر شستوشو داده شد. سپس الکترود داخل سل حاوي 10 میلیلیتر بافر استات داراي pH =4/8 قرارگرفته و یک پیشتیمار الکتروشیمیایی در پتانسیل 1/8 و زمان 300 ثانیه بهمنظور فعالسازي سطح الکترود بر روي آن انجام شد. در مرحله بعد شرایط تثبیت
DNA با استفاده از نرم افزار RSM بهینهسازي شد که مقادیر بهینه شده براي رسیدن به بیشترین سیگنال بازهاي آلی در جدول زیر ارائه شده است.
جدول -1 مقادیر بهینهسازي شده توسط مدل براي فاکتورهاي مختلف
براي بررسی بر همکنش بین داکسی ریبونوکلئیک اسید دورشتهاي و اسیدفولیک، حسگر در شرایط بهینه مجددا تهیه و به سلول الکتروشیمیایی حاوي 10/0 میلی لیتر محلول بافر تریس 0/1 مولار با pH =7 و حاوي مقدار 1 میکرومولار اسیدفولیک منتقل گردید و محلول در مدت 300 ثانیه با سرعت 200 دور بر دقیقه هم زده شد.
الکترود فوق پس از شستوشو در بافراستاتی به سلول الکتروشیمیایی حاوي 10/0 میلی لیتر بافر استاتی 0/5 مولار - - pH=4/8 منتقل شد و ولتامتري پالس تفاضلی با پتانسیل مرحلهاي 0/00495و مدولاسیون دامنه 0/1 ولت و سرعت روبش 50 میلیولت بر ثانیه در محدوده +0/40 تا +1/40 ولت نسبت به الکترود مرجع نقره/کلرور نقره انجام شد. بدین ترتیب بیشینه حاصل از اکسایش بازهاي آدنین و گوانین داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشتهاي، پس از برهمکنش با اسیدفولیک با استفاده از فیلتر ساوتیزکی-گولار با پهناي 0/01 ولت تصحیح زمینه و ثبت شد.
در نهایت، اختلاف بین جریان اکسایش بازهاي گوانین و آدنین داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشته اي قبل و پس از بر همکنش با اسیدفولیک به عنوان جریان تجزیه اي ثبت گردید. همانطورکه در شکل زیر دیده میشود، تغییرات ناشی از واکنش با اسیدفولیک با بازآلی گوانین قابل توجه و تکرارپذیر نبوده، درحالیکه افزودن اسیدفولیک به محیط بافر تریس کاهش قابلتوجه و تکرارپذیري را در پیام جریان ناشی از اکسیداسیون آدنین ایجاد میکند که با افزایش غلظت، این تفاوت جریان - بین پیام اولیه ناشی از اکسیداسیون آدنین و پیام بهدست آمده بعد از افزودن اسیدفولیک - افزایش مییابد.
شکل -1 تأثیر افزودن اسیدفولیک در غلظتهاي مختلف بر پیام ناشی از جریان بازهاي آلی آدنین و گوانین
رابطه خطی بین پیام تجزیهاي و غلظت اسیدفولیک از طریق دنبال کردن اختلاف شدت جریان اکسایش بازهاي گوانین و آدنین داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشته اي، قبل و پس از برهمکنش با این ترکیب بهدست آمد. بدین ترتیب الکترود مغزمداد اصلاح شده با داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشتهاي در شرایط بهینه - غلظت 24/0 میلی گرم بر لیتر داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشته اي و زمان تغلیظ داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشتهاي 304 ثانیه و پتانسیل تغلیظ +0/70 ولت - تهیه شد. سپس الکترود مغزمداد اصلاح شده با داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشته اي به مدت 7 دقیقه در محلول بافر تریس داراي pH= 8/5حاوي مقادیر مختلف اسیدفولیک قرار گرفت. محلول در سرعت 200 دور در دقیقه هم زده شد و پس از آن الکترود بلافاصله از محلول خارج شد و با 10 میلی لیتر بافر تریس داراي pH= 8/5 به مدت 5 ثانیه شسته شد.
الکترود به سلول الکتروشیمیایی حاوي 10/0 میلی لیتر محلول بافر استاتی 0/5 مولار داراي pH= 4/8 منتقل شد و ولتامتري پالس تفاضلی پتانسیل مرحلهاي 0/00495و مدولاسیون دامنه 0/1 ولت و سرعت روبش 50 میلیولت بر ثانیه در محدوده +0/40 تا +1/40 ولت نسبت به الکترود مرجع نقره/کلرور نقره انجام گرفت. پیامهاي ولتامتري پالس تفاضلی - DPV - پس از تصحیح زمینه با فیلتر ساوتیزکی-گولار با پهناي پیک 0/01 ولت ثبت گردید. در نهایت پیام تجزیهاي از طریق محاسبه کاهش جریان اکسایش باز آلی آدنین داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشتهاي ، قبل و پس از برهمکنش با اسیدفولیک بهدست آمد. شکل2 میزان کاهش در پیام اکسایش آدنین در حضوراسیدفولیک را نشان میدهد. همانطور که مشاهده میشود، اسیدفولیک در دامنه غلظت 0/1 تا 10میکرومول داراي رابطه خطی با میزان کاهش پیام است.
شکل-2 بررسی منحنی کالیبراسیون اسیدفولیک از طریق دنبال کردن پیام آدنین
به منظور بررسی دقت روش، تعداد 10 اندازه گیري ولتامتري پالس تفاضلی - DPV - از محلول حاوي 1/0 میکرومولاراسیدفولیک با استفاده از روش پیشنهادي بر روي الکترود مغزمداد اصلاح شده با داکسی ریبونوکلئیک اسید دو رشتهاي انجام شد.
