بخشی از مقاله
چکیده:
براي ﲣمﲔ وزن مولکوﱄ پروتئﲔها در الکﱰوفورز، از نشانگرهایی استفاده می شود که ﳐلوط چند پروتئﲔ مشخص با وزن مولکوﱄ معﲔ هستند. در این زمینه اقدام به تولید یک نشانگر وزن مولکوﱄ پروتئﲔ ﳕوده اﱘ که هم براي ﲣمﲔ وزن مولکوﱄ پروتئینها درSDS-PAGE قابل استفاده است و هم به عنوان کنﱰل مثبت و وسیله اي براي ﲣمﲔ اندازه پروتئینها در وسﱰن بلاﲥایی که با آنﱵ بادي Anti His-tag اﳒام میشوند، کاربرد دارد. بدین منظور ژن کیتیناز جدا شده از باکﱰيB.pumilus که داراي ناحیه اي مشخص به نام chitin binding domain - CBD - است و سبب اتصال این آنزﱘ به کیتﲔ می شود، انتخاب شد.
با طراحی پراﳝر و ساخت دستواره هاي ﳐتلف از ژن کیتیناز و ﳘسانه سازي و بیان آهنا در باکﱰيE.coli ، پروتئینهاي ﳐتلفی با وزن مولکوﱄ متنوع تولید گردید. پروتئینهاي بیان شده با استفاده از خاصیت افینیﱵ آهنا نسبت به کیتﲔ خالص سازي شده وبا نسبت مناسب ﳐلوط گشتند. از آﳒایی که براي بیان این دستواره ها از پلاﲰیدpQE30 استفاده شد، لذا پروتئﲔهاي بیان شده داراي یک تواﱄ شش اسید آمینهاي هیستیدین در انتهاي آمیﲏ خود هستند. نتایج الکﱰوفورز و وسﱰن بلات این نشانگر قابلیت آن را به اثبات رساند. تولید اینگونه نشانگرها ضمن اشتغال زایی، میتواند نیاز مراکز علمی و ﲢقیقاتی کشور را به این گونه مواد مرتفع ﳕاید و از خروج ارز از کشور جلوگﲑي کند.
کلمات کلیدي: نشانگر وزن مولکوﱄ پروتئﲔ، کیتیناز، وسﱰن بلات
مقدمه:
الکﱰوفورز پروتئینها در ژل اکریل آمید یک راه آم هزینه، سریع و تکرار پذیر در مطالعه پروتئﲔ هاست که به طور معمول براي بررسی مراحل خالص سازي، ﳏاسبه مقدار نسﱯ و تعیﲔ وزن مولکوﱄ پروتئﲔ ها و پپتیدها بکار می رود. در ضمن با اﳒام روش بلاتینگ بعد از آن، امکان بررسی آنﱵ ژنیسیته یا تعیﲔ تواﱄ پروتئﲔ ها و پلی پپتیدها فراهم می شود. این روش را می توان به هدف خالص سازي مقادیر آم پروتئﲔ ها نیز بکار برد. بدین ﳊاظ امروزه SDS-PAGE1 به عنوان پراستفادهترین روش در میان روش هاي الکﱰوفورزي مطرح است. براي ﲣمﲔ وزن مولکوﱄ پروتئینها با الکﱰوفورز در مطالعات و ﲢقیقات بیولوژي مولکوﱄ، از نشانگرهایی استفاده میشود که ﳐلوط چند پروتئﲔ مشخص با وزن مولکوﱄ معﲔ هستند. با مقایسه حرکت این پروتئینها با پروتئﲔ مورد مطالعه میتوان وزن مولکوﱄ آنرا ﲣمﲔ زد.
در برخی از انواع این نشانگرها از خالص سازي پروتئینهاي طبیعی نظﲑ آلبومﲔ سرم گاوي و غﲑه استفاده شده است و برخی دیگر از خالص سازي پروتئینهاي نوترکیب بدست می آیند . ﳘچنﲔ در برخی از این نشانگرها که از قیمت بالاتري برخوردارند از توالیهاي اسید آمینه اي نظﲑ His-tag استفاده شده است که قابلیت کاربرد در وسﱰن بلاتینگ را به آن نشانگر می دهد. نشانگرهاي مورد استفاده در ایران ﳘگی وارداتی بوده و توسط شرکتهاي ﲡاري بزرگی چون Fermentas،Roche وSigma تولید می شود. هیچ تولیدکننده داخلی براي این قبیل ﳏصولات وجود ندارند. در این زمینه اقدام به تولید نشانگر وزن مولکوﱄ پروتئﲔ ﳕوده اﱘ که هم براي ﲣمﲔ وزن مولکوﱄ پروتئینها درSDS-PAGE قابل استفاده است و هم به عنوان کنﱰل مثبت و وسیله اي براي ﲣمﲔ وزن مولکوﱄ پروتئینها در وسﱰن بلاﲥایی که با آنﱵ بادي Anti His-tag اﳒام میشوند، کاربرد دارد.
بدین منظور ژن کیتیناز جدا شده از باکﱰي B.pumilus که در آزمایشات قبلی بیان بالایی را به صورت نوترکیب از خود نشان داده بود انتخاب شد. پروتئﲔ کیتیناز مورد استفاده در این طرح داراي ناحیه اي مشخص به نام chitin binding domain - cbd - است که سبب اتصال این آنزﱘ به کیتﲔ می شود . با اتصال پروتئﲔ ﳏلول داراي این domain به کیتﲔ غﲑ ﳏلول می توان آنرا به راحﱵ از سایر پروتئینهاي ﳏلول جا کرد. تواﱄ اسید آمینه اي این ناحیه به این ترتیب است:با طراحی پراﳝر و ساخت دستواره هاي ﳐتلف از ژن کیتیناز جدا شده از باکﱰي B.pumilus و ﳘسانه سازي و بیان آهنا در باکﱰي E.coli ، می توان مقادیر فراوانی از پروتئینهاي ﳐتلف با وزن مولکوﱄ متنوع تولید ﳕوده و با استفاده از خاصیت افینیﱵ آهنا نسبت به کیتﲔ خالص سازي کرد.
مواد و روشها:
مواد شیمیایی مورد نیاز از شرآت هاي Merck، Roche و Sigma با خلوص مورد استفاده در بیولوژي مولکوﱄ ﲥیه شدند. آنزﱘ هاي پلیمرازي Taq و Pfu و آنزﱘ هاي ﳏدود آننده برشی به ترتیب از شرآت سیناژن، Fermentas و Roche ﲥیه گردیدند. سویههاي باآﱰي آه در این پروژه مورد استفاده قرار گرفت باآﱰي Bacillus pumilus SG2، Escherichia coli Top10F وپلاﲰیدهاي بیانی pQE30 و pGEX4T-2 بودند.DNA ژنومی باکﱰيBacillus pumilus SG2 با روشهاي معمول استخراج شد. آغازگرهاي اختصاصی ژن بگونه اي طراحی شد که پس از ﳘسانه سازي در ناقل pQE30 ، پروتئینهایی با وزن مولکوﱄ معﲔ اﳚاد کنند. ﳘچنﲔ در ﲰت 5′ آغازگرهاي رفت جایگاه برش آنزﱘ SphI ودر ﲰت 5′ پراﳝر برگشت جایگاه برش آنزﱘ KpnI تعبیه شد.
باکﱰیها درﳏیط غﲏ SOB مایع حاوي آنﱵ بیوتیک آمپیسیلﲔ و چرخش 200 دور در دقیقه آشت شدند و براي القاي بیان پروتئﲔ هاي مورد نظر ازIPTG در غلظت هنایی یک میلی مولار در زمانی آه OD باکﱰي به 0/5 رسیده بود استفاده گردید. در زماهناي 2، 4 و8 ساعت پس از القا ﳕونه برداري از کشت باکﱰي صورت گرفت. استخراج پروتئینهاي بیان شده با روش سونیکیشن اﳒام شد و براي خالص سازي پروتئینها از روش ژل فیلﱰاسیون و خاصیت افینیﱵ پروتئینها نسبت به آیتﲔ آلوئیدي استفاده گردید. ژل اآریل آمید12 درصد براي الکﱰوفورز پروتئینها بکار گرفته شد. آنﱵ بادي اولیه مورد استفاده در آزمایش وسﱰن بلات این ﲢقیق، از سرم خون موش و علیه تواﱄ اسید آمینه اي His-tag و آنﱵ بادي ثانویه که به آنزﱘ پروکسیداز ترب اسﱯ متصل شده بود، از خون خرگوش و علیه اﳝونوگلوبولﲔ موش بدست آمده بود.
نتایج و ﲝث:
با استفاده از پراﳝرهاي اختصاصی و واکنش زﳒﲑه اي پلیمراز با آنزﱘ Pfu قطعات ﳐتلفی از ژن کیتیناز بدست آمد . بگونه اي که پس از ﳘسانه سازي آهنا در پلاﲰید pQE3 پروتئینهایی با وزهناي قک، وک، وظ، ول ووث کیلودالتون اﳚاد شود. این قطعات با آنزﳝهاي SphI و KpnI در پلاﲰید مذکور ﳘسانه سازي شدند. نتیجه برش آنزﳝی پلاﲰیدهاي بدست آمده صحت ﳘسانه سازي را نشان داد. پلاﲰید pQE30 داراي یک تواﱄ شش اسید آمینه-اي هیستیدین بعد از متیونﲔ آغازین است. لذا پروتئﲔهاي بیان شده با این پلاﲰید، تواﱄ فوق را در انتهاي آمیﲏ خود دارند و با آنﱵ بادي علیه این تواﱄ قابل ردیابی و شناسایی هستند.
بدین ترتیب از نشانگر حاصل از ﳐلوط کردن این پروتئینها، هم به عنوان کنﱰل مثبت و هم براي ﲣمﲔ وزن مولکوﱄ پروتئینها در وسﱰن بلاﲥایی که با آنﱵ بادي Anti His-tag اﳒام میشوند می توان ﲠره جست.ﳘچنﲔ ژن کیتیناز با استفاده از آنزﱘ هاي SmaI و XhoI در ناقل بیانی pGEX4T-2 کلون گردید. در این سیستم تقریباً ~25 kDa به وزن مولکوﱄ پروتئﲔ هدف اضافه گشت که ﳘان وزن مولکوﱄ GST است و منجر به بیان پروتئیﲏ با وزن مولکوﱄ ~90 kDa شد. دستواره هاي ساخته شده، در باکﱰي E coli Top10F القا و بیان شدند. با الکﱰوفورز ﳕونه هاي بدست آمده در ژل SDS PAGE از بیان فراوان و اندازه پروتئﲔ هاي مورد نظر اطمینان حاصل گشت. با افزودن آیتﲔ آلوئیدي به ﳏلول پروتئینهاي بدست آمده از بیان باآﱰیها، پروتئینهاي مورد نظر بدلیل داشﱳ ناحیه cbd به آیتﲔ ناﳏلول متصل گشته و با سانﱰیفیوژ از سایر پروتئینهاي ﳏلول جدا شدند.
پس از چند بار شستشوي کیتﲔ با بافرهایی با pH و ترکیب ﳕکی متفاوت، پروتئینهایی که بطور غﲑ اختصاصی به کیتﲔ چسبیده اند جدا می شوند. ﲰت راست شکل 1 خالص شدن پروتئینهاي ﳐتلف با وزهناي مولکوﱄ منظم و نیز نشانگر حاصل از ﳐلوط کردن آهنا را در مقایسه با نشانگر استاندارد وزن مولکوﱄ شرآت Fermentas نشان می دهد. ﳘچنﲔ در ﲰت چپ این شکل, نتیجه وسﱰن بلات این نشانگر آورده شده است.تولید اینگونه نشانگرها با قیمت کمﱰ و قابل رقابت با ﳏصولات خارجی امکان پذیر بوده وضمن اشتغال زایی، می تواند نیاز مراکز علمی و ﲢقیقاتی کشور را به این گونه مواد مرتفع ﳕاید و از خروج ارز از کشور جلوگﲑي کند.
