بخشی از مقاله
بیان مسئله: از آن جایی که زهر زنبور عسل حاوی آلرژن های متعدد و پیچیده ای می باشد لذا تشخیص و پیشگویی الرژنهای عمده آن برای بیماران آلرژیک ضروری می باشد .تنوع آلرژن ها در زهر زنبورعسل در روش های تشخیصی و مدیریت درمانی بیماران آلرژیک تاثیرگذار می باشد. از آن جایی که فسفولیپاز A2 یکی از مهمترین ترکیبات آلرژن زهر زنبور عسل می باشد، لذا در این طرح اقدام به کلون نمودن و بیان ژن این پروتئین گردید.
هدف پژوهش: کلونینگ و بیان ژن پروتئین فسفولیپاز A2 زنبور عسل - آپیس ملیفرا -
روش و چگونگی انجام پژوهش: ابتدا استخراج توالی ژن فسفولیپاز A2 زهر زنبورعسل - آپیس ملیفرا - از داده پایگاه NCBI صورت گرفت. سپس بهینه سازی کدون ها جهت بیان مناسب ژن در سلول هایCHO با استفاده از نرم افزارهای مرتبط انجام پذیرفت و سنتز ژن فسفولیپاز A2 و کلونینگ آن در وکتور PCDNA توسط کمپانی ماکروژن صورت گرفت. پالسمید به واسطه ترانسفکت کردن باکتری اشریشیا کالی ازدیاد یافت و سپس ترانسفکت نمودن سلول های CHO، با روش کلرور کلسیم و انتخاب سلول های حاوی پالسمید بر اساس مقاومت به آنتی بیوتیک نئومایسین در محیط کشت هامز اف 12 انجام پذیرفت. پس از 22 ساعت، سوپ سلول های ترانسفکت شده جمع آوری و مورد آزمایش SDS-PAGE قرار گرفت.
یافته ها و نتیجه گیری: در آزمایش الکتروفورز که بمنظور تایید بیان ژن فسفولیپاز A2 در سوپ سلولها انجام پذیرفت باندی قابل انتظار با وزن مولکولی حدود 22 کیلودالتون بدست آمد که با گزارشات دیگر محققین در این خصوص مطابقت داشته است. فسفولیپاز A2 یکی از قوی ترین الرژن های زهر زنبورعسل می باشد لذا بنظر می رسد که تولید پروتئین نوترکیب آن می تواند در تشخیص دقیق تر و جزئی تر آلرژی به زهر زنبور عسل در مقایسه با کاربرد پروتئین های تام زهر کمک کننده باشد.
مقدمه:
زهر زنبور عسل حاوی ترکیبات مختلفی مانند انواعی از پروتئین ها - فسفولیپازA2 ، هیالورونیداز، .اسید فسفاتاز - و پپتیدهایی مانند ملیتین، آپامین - و ترکیباتی با وزن مولکولی پایین مانند هیستامین، نورآدرنالین، سروتونین و دوپامین می باشد. انواعی از این ترکیبات بعنوان آلرژن در بدن افراد حساس مورد گزش مطرح بوده و قادر به ایجاد واکنش های متفاوت در حد ایجاد تورم، خارش و کهیر، تا ایجاد شوک انافیالکتیک هستند.
از میان این ترکیبات، فسفولیپاز A2 بعنوان یکی از آلرژن های عمده محسوب می گردد و 11 درصد وزن خشک زهر زنبور عسل را به خود اختصاص می دهد این آنزیم می تواند سبب القای پاسخ های ایمنی شامل تولید آنتی بادی IgE گردد. این آنزیم در هیدرولیز فسفولیپیدهای غشایی و ایجاد لیزوفسفولیپید و آراشیدونیک اسید نقش دارد. آراشیدونیک اسید یک مولکول سیگنالی مهم و پیش ساز لوکوترین ها و پروستاگالندین ها می باشد.
همچنین می تواند بواسطه صدمه به غشای سلولی سبب نکروز و مرگ آن ها شود و سبب آزادسازی اینترلوکین 33 می گردد. این سیتوکاین باعث فعال سازی پیش سازهای لنفوسیت های T-helper2 تولید کننده اینترلوکین 5 و اینترلوکین 13 می گردد که می تواند در افراد مستعد در پروسه تولید پاسخ های IgE نقش داشته باشد. فسفولیپازA2 شامل چندین خانواده پروتئینی با فعالیت آنزیمی مشترک است.
دو خانواده مهم آن عبارت از انواع ترشحی و سیتوسولیک - سیتوپالسمی - می باشد که برای فعالیت شان نیازمند به یون کلسیم می باشند. فرم ترشحی فسفولیپازA2 در سموم مارها، و برخی گونه های زنبور عسل دیده می شوند که می توانند بر مبنای همولوژ ی توالی طبقه بندی گردند. از آن جایی که فسفولیپازA2 یکی از مهمترین ترکیبات الرژن زهر زنبور عسل می باشد لذا بنظر می رسد که تولید پروتئین نوترکیب آن می تواند در تشخیص دقیق تر و جزئی تر آلرژی به زهر زنبور عسل در مقایسه با کاربرد پروتئین های تام زهر کمک کننده باشد.
مسئله: از آن جایی که زهر زنبور عسل حاوی آلرژن های متعدد و پیچیده ای می باشد لذا تشخیص و پیشگویی آلرژن های عمده ان برای بیماران آلرژیک ضروری می باشد زیرا که تنوع در آلرژن ها در روش های تشخیصی و مدیریت درمانی بیماران آلرژیک دارای آنتی بادی IgE علیه آلرژن های ویژه زهر زنبور عسل تاثیرگذار می باشد. از آن جایی که فسفولیپازA2 یکی از مهمترین ترکیبات آلرژن زهر زنبور عسل می باشد لذا بنظر می رسد که تولید پروتئین نوترکیب آن می تواند در تشخیص دقیق تر و جزئی تر آلرژی به زهر زنبور عسل مفید واقع گردد. لذا در این طرح اقدام به کلونینگ و بیان ژن پروتئین فسفولیپاز A2 زنبور عسل آپیس ملیفرا گردید.
