بخشی از مقاله
چکیده:
بیماري رایزومانیا یکی از مخربترین بیماريهاي چغندر قند است. عامل این بیماري ویروس زردي نکروتیک رگبرگ چغندرقند، و قارچ Polymyxa betae به عنوان ناقل طبیعی این ویروس شناخته شده است. در حال حاضر، شناسائی گیاهان آلوده بر اساس مشاهده میکروسکوپی، روشهاي مولکولی از قبیل Real time-PCR یا روشهاي سرولوژیکی مانند DAS-ELISA، انجام می پذیرد. علیرغم سهولت و قابلیت بالاي استفاده از روشهاي سرولوژیکی در شناسائی پاتوژنهاي گیاهی، تهیه آنتیباديهاي اختصاصی همواره از مهمترین موانع در استفاده از آن بوده است. در این تحقیق براي اولین بار، با استفاده از تکنیک جدید Phage display، آنتی بادي مونوکلونال نوترکیب علیه پروتئین گلوتاتیون اس ترانسفراز1 تهیه شد. نهایتا آنالیزهاي تکمیلی ELISA و وسترن بلات اختصاصی بودن آنتی بادي هاي بدست آمده را تایید نمودند.
مقدمه:
بیماري رایزومانیا2 توسط ویروس رگبرگ زرد نکروتیک چغندرقند Beet necrotic yellow vein virus - BNYVV - ایجاد میشود. این بیماري به عنوان یکی از مخربترین بیماريهاي چغندر قند - Beta vulgaris L. - شناخته شده که در بیشتر مناطق دنیا یافت شده است. مهمترین نشانه این بیماري ایجاد ریشه هاي فرعی فراوان روي غده است. این حالت را ریشه مویی - hairy root - گویند که باعث کاهش میزان قند تولیدي میگردند. انتقال طبیعی این بیماري توسط میکروارگانیسمی قارچ بهنام P. betae از شاخه plasmodiophoromycota صورت می گیرد. این ناقل توسط آب آبیاري، ادواتکشاورزي و باد به مناطق مجاور منتقل میشود.
بعد از ایجاد و استقرار آلودگی در مزرعه، ویروس BNYVV به مدت 25 سال قادر است درون اسپورهاي استراحتی قارچ مذکور باقی بماند P.betae . - Abe & Tamada, 1986 - انگل اجباري ریشه گیاهان تیره Chenopodiaceae به شمار میرود. بر خلاف بیماري رایزومانیا و علیرغم حضور در اغلب مناطق چغندر کاري، این قارچ در مناطق معتدل خسارت اقتصادي قابل توجهی ندارد.تا بهحال ژن هاي طبیعی مقاومت، به عنوان تنها عامل موثر در کنترل این بیماري استفاده شدهاند. ژن Rz1 به عنوان اولین منبع مقاومت به این بیماري در سال 1983 شناسایی شد. این ژن که بعدها در برنامه هاي اصلاحی چغندرقند استفاده گردید، باعث ایجاد مقاومت زیاد به انواع پاتوتیپهاي A و B ویروس عامل بیماري گردید. به تدریج ژنهاي Rz2 ، Rz3 و Rz4 به عنوان منابع جدید مقاومت شناسایی شدند.
اغلب ارقام مقاوم به رایزومانیا که در سراسر جهان کشت می شوند داراي مقاومت تک ژنی به این بیماري هستند که همواره امکان زایل شدن این نوع از مقاومت با سویههایی از ویروس با قابلیت بیماريزایی زیاد وجود دارد . - Biancardi et al., 2002 - یک حالت جایگزین براي ایجاد مقاومت به بیماري رایزومانیا، شناسایی و استفاده از ژرمپلاسمهاي مقاوم به قارچ P.betae میباشد تا به این وسیله در انتقال و ورود ویروس BNYVV به گیاه اختلال ایجاد شود. بیشتر ارقام تجاري موجود در دنیا به قارچ P.betae حساس می باشند . - Asher et al., 2002 - مقاومت طبیعی در برابر قارچ P. betae در برخی گونه هاي وحشی مانند Beta patellaris دیده شده است.
در این گونه وحشی، قارچ P.betae پس از ایجاد آلودگی اولیه، قادر به تکمیل سیکل رویشی و زایشی خود نمی باشد. این وضعیت به عنوان عاملی موثر در جهت جلوگیري از آلودگی به رایزومانیا کافی به نظرمیرسد . - Paul et al., 1992 - ارزیابی مقاومت ژرمپلاسمها به P.betae نیاز به یک سیستم تشخیصی و سنجشی دقیق دارد تا بتواند در شرایط خاك آلوده، گیاهانی را که داراي میزان اینوکلوم اندکی از قارچ هستند، شناسایی نماید. تا به حال روشهاي مختلفی از قبیل هیبریداسیون DNA، PCR کمی3 و روشهاي سرولوژیکی4 براي تشخیص، بررسی کمی میزان آلودگی و ارزیابی مقاومت به قارچ P.betae به کار رفته است.
روش هاي سرولوژیکی به صورت مرسوم براي شناسایی و مدیریت بیماري هاي گیاهی مورد استفاده قرار می گیرند. به دلیل پایداري کمتر پروتئین ها نسبت به DNA، روش هاي تشخیصی سرولوژیکی قابلیت تمایز بین مرده و یا زنده بودن قارچ را دارند. علاوه بر این، روش سرولوژیکی الیزا قابلیت ارزیابی کمی پروتئین را نیز دارد و استفاده از این روش نیازي به تجهیزات پیشرفته آزمایشگاهی ندارد. همچنین آنتی بادي هاي نوترکیب، خصوصا در فرم single chain fragment variable - scFv - ، به راحتی در باکتري بیان گردیده و به صورت انبوه و ارزان تولید می شود. تا به حال، این قبیل آنتیباديها براي تشخیص عوامل مختلف ویروسی و قارچی استفاده گردیدهاند . - Kingnorth et al., 2003 -
براي تولید آنتی بادي اختصاصی بر علیه پاتوژن هاي گیاهی، از قبیل قارچ هاي بیماري زا، عصاره خالص بافت و یا ریسه هاي قارچ به عنوان ایمونوژن ضروري می باشد. در مورد قارچ هاي پارازیت اجباري، به علت عدم قابلیت رشد بر روي محیط کشت، فراهم آوردن منابع خالص شده قارچ جهت ایمنی زایی مشکل میباشد. بنابراین در مورد قارچ P.betae بهعنوان یک قارچ انگل اجباري و فاقد ریسه، تعیین یک پروتئین ایمونوژن اختصاصی موجود در تمامی حالتهاي مورفولوژیکی قارچ، ضروري می باشد. پروتئین گلوتاتیون-اس- ترانسفراز به عنوان یک فرآورده بیولوژیک موجود در تمامی حالتهاي رشدي از قبیل زئوسپور، اسپورانژیوم و اسپورهاي استراحتی که ایمونوژن قوي نیز به شمار می روند، میتواند به عنوان یک گزینه مناسبی براي شناسایی این قارچ باشد.
GST ها شامل گروهی از آنزیم ها هستند که قادر به انجام چندین واکنش در انواع پیش ماده ها می باشند.. - Hayes and Pulford, 1995 - بر اساس بررسی هاي به عمل آمده، تا کنون آنتی بادي منوکلونال نوترکیب اختصاصی علیه قارچ P. betae تهیه نشده است و انجام آزمون هاي سرولوژیکی براي تشخیص این قارچ صرفا با استفاده از آنتی بادي هاي پلی کلونال انجام شده است. در این تحقیق براي اولین بار آنتی بادي اختصاصی منوکلونال نوترکیب علیه قارچ مذکور تهیه خواهد شد که می تواند براي تشخیص نمونه هاي آلوده و تعیین کمی میزان آلودگی در این نمونهها به کار رود.
مواد و روش ها
جداسازي آنتی بادي هاي منوکلونال نوترکیب اختصاصی:
پروتئین خالص GST تهیه شده - توسط بصیرت و همکاران، - 1390 در ایمونوتیوب ثابت گردیده و پس از بلوکه شدن فضاهاي خالی توسط شیر بدون چربی%2 ، ذرات فاژ - از کتابخانه فاژي - Tomlinson I & J به لوله افزوده و فاژهاي غیر اختصاصی آنها حذف شدند. سپس فاژهاي اختصاصی متصل به تیوب، جداسازي و براي تکثیر وارد سلولهاي در حال رشد سویه E.coli TG1 گردیدند. فاژهاي تکثیر یافته دوباره جدا سازي شده و براي افزایش ذرات اختصاصی داراي قابلیت اتصال به پروتئین GST سیکل فوق تکرار شد. پس از انجام سه دور چرخه فوق، در حدود 96 عدد تک کلونی داراي فاژهاي جداسازي شده انتخاب و به صورت جداگانه کشت شده و جهت تولید scFv مربوطه با IPTG تحریک شدند. scFv تولید شده در باکتري وارد محیط کشت گردیده و پس از جداسازي با سانتریفیوژ براي تست الیزا و شناسایی کلونهاي اختصاصی مورد استفاده قرار گرفتند. کلون هاي مولد scFv اختصاصی جداسازي و براي تعیین تنوع با روش هاي RFLP و تعیین ترادف بررسی شدند. آنالیزهاي تکمیلی وسترن بلاتینگ و الیزا بر روي scFv هاي اختصاصی منفرد صورت گرفتند - Safarnejad et al., 2009, Safarnejad et al.,.2008 -
- خالص سازي و تولید انبوه آنتی بادي هاي نوترکیب:
براي خالص سازي و تولید انبوه آنتی بادي هاي نوترکیب، سویه باکتریایی E.coli HB2151 و یا BL21-DE3 با پلاسمیدهاي pIT حامل ژن هاي scFv اختصاصی تراریخته شدند. باکتري تراریخته در محیط کشت LB حاوي آنتی بیوتیک آمپی سیلین در 37 درجه سانتیگراد رشد یافته و هنگامی که OD محیط کشت به یک رسید، IPTG استریل به کشت باکتریایی تا غلظت 1mM افزوده شده و کشت در دماي 30 درجه سانتی گراد ادامه یافت. پس از سه ساعت سلول هاي باکتریایی با سانتریفیوژ جداسازي و scFv تجمع یافته در فضاي پیش پلاسمایی با روش شوك اسمزي جدا گردید. خالص سازي آنتی بادي نوترکیب موجود - scFv - بر روي ستون Ni-NTA-agarose انجام شد. تعیین خلوص و میزان آنتی بادي نوترکیب حاصله با روش هاي SDS-PAGE و اسپکتروفتومتري صورت گرفت - . - Safarnejad et al., 2008
نتایج و بحث:
آنالیز تکمیلی توسط آزمونهاي الایزا و وسترن بلات انجام شد که نتایج این آزمونها صحت کارکرد آنتی بادي تولیدشده را تایید نمودند - جدول 1 و شکل . - 17 نمونه از آنتی بادي هایی که در تست الیزا ضریب جذب نوري بالاتر از عدد 3 را نشان دادند، جهت بررسی واکنش متقاطع، انتخاب و در واکنش با پروتئین هايGST، BSA5 و IMP6 مورد مقایسه قرار گرفتند.
