بخشی از مقاله
چکیده
ویروس تریستزای مرکبات - - CTV باعث بروز یکی از مهمترین و مخربترین بیماریهای مرکبات در سراسر دنیا میشود. در ایران نیز وجود این ویروس از نقاط مختلف کشور گزارش شده است. تریستزا احتمالاً از آسیا منشا گرفته و از طریق انتقال مواد گیاهی آلوده مانند نهال، پیوند آلوده و یا شتههای ناقل بهطور وسیعی گسترش یافته است. بررسی های انجام شده نشان می دهد که جدایه های این ویروس از تنوع ژنتیکی زیادی برخوردارند. هدف ار این تحقیق بررسی پروفایل ژنوتیپ این ویروس در آلودگی های مرکبات در کشور می باشد. در بازدیدهایی که در سال 1384 و 1385 از مناطق مرکبات کاری استانهای فارس و مازندران بهعمل آمد، از درختان با علائم مشکوک به تریستزا شامل زردی، خشکیدگی سرشاخه و زوال نمونه برداری گردید .
علاوه بر این تعدادی نمونه از درختان به ظاهر سالم تهیه گردید. آلودگی نمونهها با استفاده از آزمون الیزا - Indirect - ELISA، تعیین گردید. پس از استخراج RNA کل از بافتهای گیاهی آلوده، به منظور تعیین ژنوتیپ-های موجود در جدایههای CTV در این دو استان از یازده جفت آغازگر استاندارد مربوط به پنج ناحیه مختلف ژنوم تریستزا در آزمون RT-PCR استفاده گردید. نتایج این بررسی نشان داد که در بین جدایه های استان مازندران تنها در یکی از جدایه ها تمام ژنوتیپ های VT,T30,T36 و T3 وجود داشت و بقیه جدایه ها بصورت مخلوطی از سه ژنوتیپ VT,T30,T3 بودند. با توجه به عدم واکنش جدایه های استان فارس با تعدادی از آغازگرها ، جدایه های استان فارس دارای ترکیبی غیر معمول از ژنوتیپ های شناخته شده تریستزا می باشند.
مقدمه
ویروس تریستزاي مرآبات به طور گسترده اي در مناطق مرآبات خیز دنیا وجود دارد و باعث ایجاد یکی از مهمترین بیماريهاي اقتصادي در درختان مرآبات میشود. ویروس تریستزا داراي تنوع بیولوژیکی و ژنتیکی زیادي است. تعداد زیادي جدایه یا نژاد بیولوژیکی مشخص شده است آه باعث ایجاد علائم مشخصی نظیر زوال، زردي نهال، رگبرگ روشنی، و چوب پنبه ای شدن رگبرگ ها می شود. این علائم بسته به جدایه یا جدایه های ویروس، نوع پایه، زمان آلودگی، ترآیب پایه و پیوندك و شرایط محیطی می تواند بسیار متنوع و متغیر باشد 1 - و. - 10 نتایج تحقیقات انجام شده بیانگر آن است کهCTV معمولا به صورت مخلوطی از ژنوتیپ های مختلف می باشد و تعیین این ژنوتیپ ها از نقطه نظر اپیدمیولوژی حائز اهمیت است - 8 و . - 12
آزمون های مربوط به واکنش میزبانی و آزمون های سرولوژي تنها قادر به شناسائی CTV هستند و نمی توانند بین جدایه ها تمایز قائل شوند - 3 و 6 - . اخیرا 11 جفت مارکرمولکولی برای پنج ناحیه مختلف ژنوم CTV طراحی شده که برای تعیین ژنوتیپ های موجود در آلودگی های طبیعی استفاده می شود. - 8 و . - 12 از این مارآرهاي مولکولی همچنین براي آنالیز زیر جدایه هاي CTV منتقل شده با شته با موفقیت استفاده گردیده است - . - 4هدف از این تحقیق مطالعه ژنوتیپ هاي CTV موجود در جدایه هاي استان های مازندران و فارس با استفاده از مارآرهاي مولکولی چندگانه میباشد.
مواد و روشها جمعآوري و تعیین میزان آلودگی نمونهها
از درختان مرکبات با علائم زوال، زردي و سرخشکیدگی مناطقی از استان های فارس و مازندران نمونه برداري انجام گرفت. نمونه برداري از درختان پرتقال، نارنگی محلی، لیموترش، لیموشیرین، نارنگی پیوند شده روي پایه لیموترش، نارنگی آنشیو وآلمانتین انجام گرفت. براي تشخیص CTV در نمونه ها از آزمون الیزاي غیرمستقیم - - 5 با آنتیسرم شرآت Agritest استفاده گردید.
استخراج آر.آن.اي ویروس و واآنش RT-PCR
براي استخراج آر.ان.اي ویروس ترآیبی از سه روش مکنزي و همکاران - 11 - ، بوم و همکاران - - 2 و هیلستون و همکاران - 7 - استفاده گردید. از آر.ان.اي استخراج شده براي واآنش نسخهبرداري معکوس - Reverse transcription, RT - استفاده گردید . cDNA به دست آمده از واآنش RT با واآنش زنجیرهاي پلی مراز - PCR - تکثیر شد. در این آزمون از 11 جفت آغازگر مربوط به نواحی مختلف ژنوم تریستزا استفاده گردید . - 8 - محصول PCR در ژل آگاروز یک درصد الکتروفورز گردید. برای تعیین ژنوتیپ های موجود در فارس و مازندران از روش هیلف و گارنزی - 8 - استفاده شد. در این روش از چهار جدایه T36 , T30 , T3 و VT استفاده گردید. بسته به اینکه کدام آغازگر با جدایه های مزبور واکنش نشان می دهند در یکی از این چهار ژنوتیپ قرار می گیرند
بحث ونتیجه گیری علائم و آزمون الیزا
در طی بازیدهاي انجام شده از باغ های مرآبات استان های فارس و مازندران علائم متنوعی که می توانست مربوط به ویروس تریستزا باشد در نواحی مختلف مشاهده گردید. از ٨5 نمونه استان مازندران و ٢٠ نمونه استان فارس به ترتیب ١٨و ١٤ نمونه در آزمون الیزا به CTV آلوده تشخیص داده شد.
آزمون PCR
برای مشخص نمودن ژنوتیپ های جدایه های استان فارس و مازندران از 11 جفت آغازگر مربوط به 5 ناحیه از ژنوم CTV استفاده گردید. در این آزمون از 18 جدایه مثبت در آزمون الیزا از مناطق فارس و مازندران استفاده شد. در بین جدایه های استان مازندران تنها در یکی از جدایه ها تمام ژنوتیپ های VT, T30,T36 و T3 ردیابی شد. بقیه جدایه های شمال بصورت مخلوطی از سه ژنوتیپ T30,T3 و VT بودند در حالیکه ژنوتیپ T36 در آنها ردیابی نشد. جدایه های جنوب یک ترکیب کامل و معمول از مارکرهای مولکولی استاندارد را نداشتند. به طوریکه آنالیز نتایج آزمون PCR و مقایسه نتایج با روش هیلف و گارنزی - - 8
مشخص نمود که جدایه-های جنوب با مارکرهای مولکولی استفاده شده به طور کامل واکنش مثبت نشان نمی دهند و یک ترکیب غیر معمول از ژنوتیپ های موجود را داشتند. .همه جدایه-های استان فارس و مازندران با آغازگر T30K17 واکنش مثبت نشان دادند. بنابراین نتایج این تحقیق نشان داد که آلودگی های طبیعی مرکبات به CTV در استان های فارس و مازندران به صورت مخلوطی از ژنوتیپ های میباشد و مخلوط این ژنوتیپ ها در مناطق مورد مطالعه به استثناء یک جدایه با ترکیب معمول ژنوتیپ ها استاندارد که در مناطق دیگر گزارش شده است مطابقت ندارد.
