بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق، روشهای مستقیم و غیر مستقیم ردیابی ویروس تریستزای مرکبات - Citrus tristeza virus, - CTV در شته سبز پنبه مورد ارزیابی قرار گرفت. به این منظور، جدایه SD4 از کلکسیون ویروسی پژوهشکده مرکبات و میوه های نیمهگرمسیری به کار گرفته شد. در روش غیرمستقیم، آزمون گیاه محک، تحت شرایط کنترل شدهی گلخانه انجام شد. سه ماه پس از انتقال، حضور ویروس در گیاهان گیرنده بر اساس علایم تشخیص داده شد. حضور CTV در گیاهان محک، با آزمون RT-PCR دو مرحلهای با جفت آغازگرهای اختصاصی T36CPF/T36CPR بر اساس RNA استخراج شده به روش SDS-Potassium acetate مورد تایید قرار گرفت. در تشخیص مستقیم ویروس از شتهها، از تکنیکهای RT-PCR و RT-nested-PCR استفاده شد. نتیجه آزمون RT-PCR یک مرحله ای با RNA استخراج شده از شتهها به روش ترایزول و آغازگرهایT36CPF/T36CPF، باندهای خفیفی به طول 672 جفت باز بود. اما با انجام مرحله دوم PCR، براساس فرآورده به دست آمده و با استفاده از جفت آغازگرهای T36CPF/P25R، قطعات مشخص با اندازه 362 جفت باز حاصل گردید.
واژگان کلیدی: ردیابی، ویروس تریستزای مرکبات، شته سبز پنبه
-1 مقدمه
ویروس تریستزای مرکبات متعلق به جنس Closterovirus از تیره Closteroviridae می باشد. این ویروس عامل مهمترین بیماری ویروسی مرکبات است . - 13 - پراکنش CTV به مناطق جدید با جابهجایی مواد تکثیری آلوده و گسترش درون منطقهای عمدتاً با کمک چند گونه شته انجام میشود - . - 22 شته قهوهای مرکبات - Toxoptera citricida Kirkaldy - ، کارآمدترین ناقل ویروس در سراسر جهان است . - 19 - این شته در بعضی مناطق مثل آمریکای شمالی و حوزهی مدیترانه گزارش نشده است - . - 23 در غیاب شته قهوهای در این مناطق، شته سبز پنبه - Aphis gossypii Glover - که دومین ناقل کارآمد ویروس است، به عنوان ناقل اصلی محسوب میشود 6 - ، . - 10
شته پنبه علاوه بر تغذیه از شیره گیاهی و تولید عسلک، با انتقال ویروس باعث خسارت جدی به محصولات کشاورزی میشود. مشخص شده که این شته در انتقال حدود 76 بیماری ویروسی نقش دارد - . - 9 چندین تکنیک مولکولی در ردیابی ویروسها در ناقلین به کار رفته است. کاربرد RT-PCR در تشخیص ویروسهای CTV و PLRVصرفاً با استفاده از روش استخراج کارآمد امکان پذیر است 11 - ، 15، . - 20 واکنش RT-nested-PCR، یکی دیگر از تکنیکها جهت ردیابی ویروس در ناقل است که در این روش، فرآورده مرحله اول PCR، به عنوان الگو، در مرحله دوم مورد استفاده قرار میگیرد. این روش از حساسیت بیشتری نسبت به RT-PCR برخوردار است و میتواند مقادیر جزئی RNA را در ناقل ردیابی کند 20 - ، - 25
نهایتاً. روش Real-time RT-PCR بر مبنای عصاره استخراج شده از شتهها و یا پارتیکل های به دام افتاده از شتههای له شده روش غشای نیتروسلولزی مورد استفاده قرار گرفته است 5 - ، . - 20 ویروس تریستزا، از مناطق مرکباتخیز شمال و جنوب ایران گزارش شده است 21 - ، . - 24 در شمال ایران، شته سبز پنبه گونهای غالب بوده و گسترش طبیعی ویروس در این مناطق بعد از سه دهه محدود بودن ویروس به درختان انشوی کانون اولیه، آغاز گردیده است 17 - ، . - 18 ردیابی ویروس تریستزا در ایران، تاکنون براساس روشهای بیولوژیکی، سرولوژی و میکروسکوپ الکترونی صورت گرفته است 1 - ، 4، 8، . - 14 این تحقیق، اولین گزارش ردیابی مولکولی ویروس با روشهای نوین مولکولی مانند RT-PCR و RT-nested-PCR در شته سبز پنبه، مهمترین ناقل CTV، از ایران است.
-2 مواد و روشها
جدایه SD4 از کلکسیون ویروسی پژوهشکده مرکبات و میوههای نیمهگرمسیری با منشا درختان در حال زوال ساری - 2 - ، جهت آزمون انتقال ویروس انتخاب گردید. گیاهچههای مکزیکن لایم آلوده به این جدایه، به عنوان میزبان دهنده ویروس، مورد استفاده قرار گرفت. شته سبز پنبه پس از پرورش روی بوتههای خیار - Cucumis sativus - جهت آزمون انتقال مورد استفاده قرار گرفت. کلونی خالص به دست آمده روی گیاهچههای مکزیکن لایم آلوده قرار داده شد. قطعات برگ حامل شته، سپس روی گیاهچه های سالم مکزیکن لایم قرار گرفتند. زمان تغذیه شتهها از گیاهان آزمایشی برای کسب و نیز انتقال ویروس، 48 ساعت و به ازای هر گیاه محک، 20 شته در نظر گرفته شد. پس از حذف شتهها با حشرهکش دلتامترین، گیاهچهها به گلخانه خنک 24 - درجه روز و 18 درجه شب - انتقال یافتند. صحت آزمون انتقال ویروس با شته، سه ماه پس از آلوده سازی، به استناد ظهور علایم و آزمون RT-PCR تایید گردید.
استخراج RNA کل از بافت گیاهی نمونههای دارای علایم - گیاهان محک - ، با روش SDS-Potassium acetate انجام گرفت - 3 - و آزمون RT-PCR به صورت دو مرحلهای براساسشیوهنامه کیت - Fermentas - Revert Aid برای مرحله RT و آنزیم PCR Master Mix - Fermentas - برای مرحله PCR واستفاده از جفت آغازگر اختصاصی T36CPF/T36CPR ، انجام شد و نتایج در ژل آگارز %1 مورد بررسی قرار گرفت.به منظور ردیابی مستقیم ویروس در شته، از روش ترایزول مطابق شیوهنامه شرکت سازنده برای استخراج RNA کل از شتهها استفاده گردید. واکنش RT-PCR به صورت یک مرحلهای با استفاده از اسید ریبونوکلئیک کل استخراج شده و با کمک آنزیم - Fermentas - AMV Reverse Transcriptase با آغازگرهای اختصاصی T36CPF/T36CPR براساس روش توصیف شده توسط - - 7 به کار رفت. محصول نهایی این واکنش در nested-PCR با استفاده از آغازگرهای T36CPF/P25R استفاده شد . - 20 -
-3 نتایج و بحث
پس از گذشت سه ماه از آلوده سازی گیاهان محک مکزیکن لایم با شته سبز پنبه و نگهداری تحت شرایط کنترل شده دمایی گلخانه، علایم رگبرگ روشنی در گیاهان مکزیکن لایم نمایان شد - شکل1، . - A نموده سازی بیولوژیکی با استفاده از گیاهان محک به عنوان ابتداییترین آزمون در تشخیص ویروس در ناقل می باشد. از مزایای این آزمون، سنجش عینی فعالیتهای بیولوژیکی از قبیل توان انتقال، تکثیر براساس تولید علایم است. ولی این روش معایبی از جمله زمان طولانی برای بروز علایم بیولوژیکی، نیاز به شرایط گلخانهای خاص، گیاه محک مناسب دارد و این مسائل منجر به بالابودن هزینههای این تکنیک میگردد . - 12 - به منظور تایید نتایج حاصل از آزمون بیولوژیکی، آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی CTV، استفاده شد و منجر به تکثیر قطعهای به طول حدود 672 جفت باز گردید که با اندازه قطعه مورد نظر مطابقت داشت - شکل1، . - B
نتایج الکتروفورز محصول RT-PCR یک مرحلهای، با RNA کل استخراج شده از شتهها به روش ترایزول، تشخیص CTV را در نمونههای مذکور، با ایجاد باندهای خفیفی به اندازه 672 جفت باز اثبات نمود. با انجام مرحله دوم PCR، قطعاتی مشخصی با اندازه 362 جفت باز ایجاد شد که با اندازه قطعه تکثیری در نمونه کنترل مثبت، مطابقت داشت. در شتههای تغذیه کرده از گیاهان سالم و نیز نمونههای فاقد الگو، قطعه DNA تکثیر نگردید - شکل1 ، . - C آزمون RT-nested-PCR با موفقیت برای تشخیص مقادیر جزئی پارتیکلها استفاده شده است 10 - ، . - 16 بر اساس این تحقیق، استخراج RNA با روش ترایزول، مناسبترین روش برای استخراج اسید نوکلئیک وبروس از شتهها است و ردیابی CTV با تکنیک nested RT-PCRمستقیماً، با این روش استخراج ارتباط دارد.
در واقع، تشخیص مقادیر جزئی پارتیکلها در ویروسهای منتقل شده به صورت نیمه پایا و ناپایا توسط ناقلین، به روشهای حساسی همچون RT-nested-PCR نیاز دارد.شکل –1 ردیابی ویروس تریستزا در شته سبز پنبه به صورت غیر مستقیم با آزمون بیولوژیکی گیاه محک - A - ، تایید آلودگی با تکنیک RT-PCR در ژل آگارز .%1 چاهکها: -1 کنترل مثبت، 2 و-3 گیاهان محک تلقیح شده با شته، -4 کنترل منفی، -5 کنترل PCR، -6 نشانگر با اندازه 100 جفت باز - B - و ردیابی مستقیم با تکنیک .RT-nested-PCR چاهکها: -1 کنترل مثبت -2 شته تغذیه کرده از گیاه منبع آلودگی، -3 شته تغذیه کرده از گیاه سالم، -4 کنترل PCR، -5 نشانگر با اندازه 100 جفت باز - C -
