بخشی از مقاله
چکیده
تاثیر بیان پروتیین مهار کننده ویروس واي سیب زمینی - PVY-HCPro - در گیاه توتون بر آلودگی چندین ویروس مطالعه شد. آلودگی توسط ویروس موزاییک توتون - TMV - در دماي 25 درجه سانتیگراد کاهش یافت ولی در دماي 33 درجه سانتیگراد تفاوتی با شاهد نداشت. در مقابل آلودگی در دماي 33 درجه سانتیگراد توسط ویروس موزائیک توتون بیان کننده ژن فلورسنت سبز - - GFP توسط HC-Pro توسعه یافت. آلودگی توسط ویروس جغ حغی توتون - TRV - به وسیله ي HC-Pro به لکه هاي موضعی محدود شد. این مقاومت توسط بیان پروتیین مهار کننده ویروس موزائیک خیار - 2b - همراه با TRV خنثی شد.
از طرف دیگر، بیان پروتیین مهار کننده ویروس واي سیب زمینی - HC-Pro - در گیاه توتون بر ویروس موزائیک خیار و ویروس موزائیک خیار تراریخته فاقد ژن - CMV-2b - 2b بی تاثیر بود. همچنین آلودگی توسط ویروس موزائیک کلم گل - - CaMV ، ویروس موزائیک بافت مرده شبدر قرمز - RCNMV - ، ویروس کوتولگی بوته انبوه گوجه فرنگی - TBSV - با بیان پروتیین مهار کننده ویروس واي سیب زمینی - PVY-HCPro - در گیاه توتون تغییري نکرد. از این رو، به نظر می رسد که PVY-HCPro قادر به تحریک پاسخ دفاعی گیاه در مقابل TMV در دماي 25°C می باشد. به علاوه، بیان پروتیین مهار کننده ویروس موزائیک خیار - CMV-2b - قادر به خنثی کردن پاسخ دفاعی فعال شده توسط PVY-HCPro در گیاه توتون می باشد.
کلمات کلیدي: پروتیین مهار کننده، توتون، ویروس، پاسخ دفاعی
مقدمه
گیاهان با استفاده از استراتژیهاي مختلف به ویروسها مقاومت نشان می دهند. یکی از این استراتژیها مقاومت علیه ویروس هاي گیاهی براساس خاموشی RNA است. در مقابل تعدادي از ویروس هاي گیاهی پروتئین هاي مهار کننده اي تولید میکنند که می تواند خاموشی RNA را محدود کنند. بیان یک مهار کننده خاموشی P1-HCPro - RNA ویروس خراش توتون - PEVدر گیاه توتون مقاومت به TMV و TBRV را افزایش داد. این مهار کننده پاسخ هاي دفاعی علیه TMV را از طریق مسیر هاي وابسته و غیر وابسته به اسید سالسیلیک و علیه TBRV مسیرهاي غیر وابسته به اسید سالسیلیک فعال شد . - 7 - در مقابل بیان PEV-P1-HCPro مقاومت به ویروس آبله آلو PPV را از طریق خنثی کردن پاسخ مقاومت غیر وابسته به اسید سالسیلیک کاهش می دهد . - 1 - بنابر این به نظر می رسد که P1-HCPro می تواند مقاومت نسبت به عده اي از ویروس ها وحساسیت نسبت به تعداد دیگري از ویروس ها را افزایش دهد. در این مطالعه تاثیر پروتیین مهار کننده ي ویروس واي سیب زمینی - PVY-HCPro - بدون حضور P1 روي مقاومت به تعدادي از ویروس هاي گیاهی بررسی شد.
مواد و روش ها
ویروس ها و گیاه: استرین تی-46 ویروس کوتولگی بوته انبوه گوجه فرنگی - TBSV - از کلکسیون مرکز تحقیقات گیاهی اسکاتلند دریافت شد. استرین U1ویروس موزائیک توتون - TMV-U1 - و ویروس موزائیک توتون بیان کننده ژن فلورسنت سبز - - 4 - - TMV-GFP، استرین Fny ویروس موزائیک خیار - CMV - و ویروس موزائیک خیار بدون ژن - CMV- 2b - 8 - 2b - ، ویروس جغ جغی توتون - TRV - و ویروس جغ حغی توتون به همراه ژن 2b ویروس موزائیک خیار - 6 - - TRV+CMV 2b - در این مطالعه استفاده شد. همچنین استرین W260 ویروس موزائیک کلم گل - - CaMV از J.E. - Schoelz دانشگاه میسوري، کلمبیا - و ویروس موزائیک بافت مرده شبدر قرمز - - RCNMV از S.A. Lommel - دانشگاه ایالتی کارولیناي شمال - دریافت شد. براي نگهداري ویروس موزائیک کلم گل - - CaMV ازشلغم - Brassica rapa cv. Just Right - و براي سایر ویروس ها از Nicotiana clevelandii یا N.
benthamianaاستفاده شد.
مطالعه گلخانه اي: در هر آزمایش سه گیاه توتون تراریخت و سه گیاه غیر تراریخت با هر یک از ویروس مایه زنی شد و این آزمایش دوبار تکرار شد. همه آزمایش ها در گلخانه اي با دماي 25°C در روز و18 °C درشب و با 16 ساعت روز انجام شد باستثنائ آزمایش هاي مربوط به TMV-GFP که در اتاقک رشد با دماي 33°C و نور ممتد انجام شد.آنالیز تجمع و حرکت سیستمیک ویروس: حرکت سیستمیک TMV-GFP با استفاده از عکسبرداري گیاهان زیرنور UV طبق روش - 4 - انجام شد. تجمع TRV، TRV+CMV2b، CMV، CMV-2b، TMV و TMV-GFP با استفاده از روش نوردرن بلات طبق روش هاي 3 - و - 4 انجام شد، تجمع RCNMV و TBSV در برگهاي مایه زنی شده و برگهاي بالایی بوسیله آزمون مایهزنی برگشتی در گیاهان N. clevelandii و N. benthamiana انجام شد. تجمع CaMV بوسیله PCR و مایهزنی برگشتی روي شلغم انجام شد.آنالیز تجمع پروتئین : استخراج پروتئن تام، جدا کردن پروتئین ها با استفاده از سیستم SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از روشهاي - 5 - انجام شد.
نتایج و بحث
-1 اثر ژن HCPro ویروس واي سیبزمینی روي آلودگی به TMV-GFPو:TMV مایهزنی توتونهاي کولتیوار Samsunداراي ژن مقاومت NN تراریخته با ژن HCPro ویروس واي سیب زمینی - DR17 - و غیرتراریخت با TMV منجر به تولید لکه هاي موضعی بعد از 2-3 روز در هر دو گیاه غیرتراریخت و تراریخت شد. در بیشتر آزمایش ها تعداد لکه ها کمتر و اندازه آنها در گیاه DR-17 نسبت به گیاهان غیرتراریخت کوچکتر بودند. در مقابل، گیاهان مایهزنی شده با TMV در دماي33°C منجر به بروز علایم سیستمیک در هر دو نوع گیاهان شد. بنابراین اثر ژن HCPro ویروس واي سیب زمینی روي آلودگی توتون حاوي ژن NN به TMV مشابه اثر ژن P1/HCPro ویروس خراشک توتون - TEV - روي TMV در کولیتوارهاي هاوانا 425 و Xanthi NN توتون بود . - 7 -
وقتی گیاهان باTMV-GFP مایه زنی شدند هیچگونه علائم قابل مشاهده اي در گیاهانی که در دماي 25°C نگهداري شدند، ظاهر نشد. در صورتیکه نگهداري این گیاهان در دماي 33°C، منجر به سیستمیک شدن TMV-GFP در گیاه تراریخت شد، در دماي TMV-GFP 33°C در گیاهان غیرتراریخت سیستمیک نشد. بنابراین به نظر می رسد بیان ژن HCPro ویروس واي سیبزمینی قادر به خنثی کردن پاسخ مقاومت ژن NN است. این نتیجه مشابه تاثیر بیان ژن RNA-1 ویروس موزائیک خیار در توتون تراریخت میباشد . - 4 -
-2 اثر ژن HCPro ویروس واي سیب زمینی روي آلودگی به CMV و :CMV-2b مایه زنی گیاهان تراریخت و غیرتراریخت با CMV منجر به ظهورعلایم سیستمیک در هر دو نوع گیاه شد. هر چند در بعضی از آزمایش ها میزان تجمع ویروس در برگهاي بالایی - آلودگی سیستمیک - گیاهان تراریخت افزایش یافت. همچنین مایه زنی هر دو نوع توتون با CMV-2b علایمی تولید نکردند همانگونه که قبلاً هم در کولتیوار Xanthi توتون گزارش شد . - 8 - هر چند در این آزمایش میزان تجمع ویروس در گیاهان تراریخت DR-17 افزایش یافت. بنابراین بیان ژن HCPro ویروس واي سیب زمینی میزان CMV-2b و گاهاً CMV را در دماي 25°C افزایش میدهد.
-3 اثر ژن HCPro ویروس واي سیب زمینی روي آلودگی به TRV و :TRV+cmv2b مایه زنی گیاهان توتون تراریخت DR17 و غیرتراریخت با ویروس جغ جغی توتون - TRV - ابتدا منجر به تولید لکههاي نکروز موضعی و سپس علایم سیستمیک شد. نهایتاً به دنبال بروز این علایم پاسخ بهبودي - Recovery - ظاهر شد. این نتایج با گزارش - 2 - مطابقت دارد. هر چند یک هفته پس از مایه زنی توتون هاي غیر تراریخت با TRV، گیاهان کاهش رشد شدید، تغییر شکل برگ و نکروز برگها را نشان دادند. در مقابل مایه زنی توتون هاي DR17 فقط تولید لکه هاي نکروز موضعی نمود و هیچگونه آلودگی سیستمیکی - عمومی - نشان نداد. تجمع TRV در برگهاي مایه زنی شده ضعیف و در برگهاي بالایی - آلودگی سیستمیک - بوسیله آزمون نوردن بلات غیرقابل ردیابی بود.
مایه زنی توتون ها غیرتراریخت و تراریخت - DR-17 - با TRVبیان کننده ژن 2b ویروس موزائیک خیار - TRV+cmv2b - منجر به بروز علایم سیستمیک شدید در گیاهان شد. نتایج مشابه با این یافته هاي قبلا نیزتوسط Liu و همکاران 2002 گزارش شده است. در حالیکه توتون هاي تراریخت - DR-17 - مقاومت به TRV را از دست داد. هر دو نوع گیاهان تراریخت و غیر تراریخت آلودگی عمومی - سیستمیک - همراه با علایم شدید و متعاقباً بهبودي را نشان دادند. بعلاوه میزان تجمع ویروس در برگهاي مایهزنی شده گیاه تراریخت با TRV-cmv2bافزایش یافت. سطح RNAي TRV+cmv2b در برگهاي بالایی - سیستمیک - گیاهان تراریخت به میزان سطح RNAي TRV و TRV+cmv2b در گیاه غیرتراریخت بود. این نتایج نشان میدهند که ژن HCPro ویروس واي سیبزمینی قادر به فعال کردن پاسخ دفاعی محدود کننده آلودگی با TRV می با شد و ژن 2b ویروس موزائیک خیار می تواند این پاسخ را خنثی کند.
-4 اثر HCPro ویروس واي سیب زمینی روي میزان تجمع :PR-1 پرس و همکاران - 2004 - مشاهده کردند که بیان P1/HCPro ویروس خراشک توتون - TEV - می تواند بیان ژن PR-1 را در بعضی توتون هاي غیر آلوده تحریک کند. در حالیکه آلودگی به TMV سطح تجمع mRNAي پروتئین PR-1 را در هر دو گیاه تراریخت و غیرتراریخت بطور مشابه افزایش می دهد. آنالیز پروتئین استخراج شده از گیاهان تراریخت DR-17 غیرآلوده با استفاده از روش وسترن بلات نشان داد که آنها پروتئین PR-1 را بیان می کنند در حالیکه این پروتئین در گیاهان غیرتراریخت غیر آلوده بیان نشد. از آنجائیکه TRVلکه هاي نکروتیک را در برگهاي مایهزنی شده و برگهاي بالایی توتون و لکههاي موضعی نکروتیک را در برگهاي مایهزنی شده گیاهان تراریخت - DR-16 - تولید کرد، ما انتظار داشتیم هر دو نوع گیاه بیان پروتئین PR-1 را نشان دهند. این فرض با استفاده از آنالیز وسترن بلات تایید شد.
-5 اثر ژن HCPro ویروس واي روي آلودگی با TBSV، RCNMV و :CaMV مطالعات علایم شناسی نشان داد که ژن HCPro ویروس واي روي الودگی به TBSV، RCNMV و CaMV تاثیري نداشت. هر چند CaMV در هر دو گیاه تراریخت و غیرتراریخت علائمی تولید نکرد ولی DNA ویروس در برگهاي مایه زنی شده قابل ردیابی بود در حالیکه در برگهاي بالایی - آلودگی سیستمیک - DNAي ویروس ردیابی نشد.
نتایج این تحقیق نشان داد که ژن HCPro ویروس واي سیبزمینی قادر است بر میزان حساسیت توتون نسبت به آلودگی به ویروسها مختلف در عدم حضور ژن P1 ویروس واي سیبزمینی نیز تأثیر بگذارد.
