بخشی از مقاله
چکیده
ویروس تریستزا یکی از مخرب ترین ویروسهاي مرکبات باشد که هر ساله خسارات فراوانی را در سرتاسر جهان به محصولات کشاورزي وارد می کند .براي تشخیص این ویروس در نمونه هاي گیاهی از روش الایزا استفاده می شود که در این روش با استفاده از آنتی بادي علیه پروتئین سطحی ویروس و یک آنتی بادي ثانویه، متصل به آنزیم وجود ویروس تشخیص داده می شود . در این پژوهش ما ابتدا با استفاده از نمونه هاي برگی آلوده به ویروس، ژن پروتئین سطحی ویروس را جداسازي نمودیم.
سپس این پروتئین را به دو طریق داخلی سلولی و خارجی سلولی تولید کردیم و در مرحله ي بعد با خالص سازي پروتئین آن را براي تزریق به خرگوش و تولید آنتی بادي پلی کلونال آماده نمودیم . براي تولید پروتئین از طریق داخل سلولی از وکتور pET28a و سویه ي میزبان - BL21 - DE3 استفاده شد و به منظور تولید خارج سلولی پروتئین سیستمRTS1 از کمپانیRoche مورد استفاده قرار گرفت.پروتئین نوترکیب تولید شده که در قسمت انتهاي N خود داراي 6×His tag بود با سیستم IMAC2 خالص سازي شد.این پروتئین خالص شده می تواند به منظور تولید آنتی بادي پلی کلونال به خرگوش تزریق شود.
کلمات کلیدي : ویروس تریستزاي مرکبات،آنتی بادي پلی کلونال،تولید پرووتئین به طریق خارج سلولی.
مقدمه
به علت خسارات فراوانی که ویروس تریستزا به محصولات درختان مرکبات وارد می نماید تشخیص گیاهان آلوده به این ویروس اهمیت وافري دارد. به متظور تشخیص گیاهان آلوده به ویروس تریستزا با روش الایزا نیاز به استفاده از آنتی بادي علیه پروتئین سطحی این ویروس است و با توجه به قیمت گزاف این ماده که توسط کمپانی هاي خارجی تولید می شود تولید داخلی آن می تواند کمک بزرگی به کاهش هزینه هاي تشخیص و جلوگیري از شیوع بیشتر این بیماري در باغات مرکبات کشور باشد . براي تولید آنتی بادي ، مرحله اول ، جداسازي ژن،تولید پروتئین سطحی ویروس و خالص سازي آن به منظور تزریق به خرگوش می باشد.
مواد و روش ها
براي تولید پروتئین سطحی ویروس از طریق داخلی سلولی، ابتدا نمونه هاي گیاهی مشکوك به آلودگی با تست الایزا - به روش دوچا-پنا و لی و به منظور اطمینان از آلودگی به ویروس تریستزا بررسی شدند . سپس از نمونه هاي مختلف گیاهی آلوده با استفاده از روش قید شده در استخراجRNA صورت گرفت و در مرحله ي بعد با استفاده از پرایمرهاي گیلکین و و واکنش RT-PCR ژن پروتئین سطحی ویروس تکثیر شد . این ژن ها با استفاده از در وکتور PGEM –Teasy کلون شدند . وکتورهاي دستورزي شده براي توالی یابی فرستاده شدند و توالی ژن هاي جدا شده مربوط به 7 ایزوله ي مختلف ویروس در بانک اطلاعاتی NCBI ثبت شد. در موحله ي بعد از ژن یکی از ایزوله هاي جدا شده براي تولید پروتئین استفاده شد.
پلاسمید هاي استخراج شده براي توالی یابی فرستاده شدند و بعد از اطمینان از تطابق با توالی موجود در بانک اطلاعاتیNCBI،پلاسمید به باکتري E.coli سویه انتقال داده شد . به منظور بیان پروتئین یک کلونی تک از باکتري هاي حاوي پلاسمید نوترکیب در 10 میلی لیتر از محیط کشتLB حاوي کانامایسین 50 μg/ml در طول شب کشت داده شد و 5 میلی لیتر از این کشت شب مانده به 250 میلی لیتر از محیط کشتLB حاوي کانامایسین50 μg/ml و گلوکز%2 افزوده شد.
این سلول ها در دماي 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند و زمانی کهOD600 آنها به حدود0/6 رسید ماده اي القاء کننده ي IPTG با غلظت نهایی 0/2 mM به محیط اضافه شد و کشت در دماي 30 درجه سانتیگراد ادامه یافت. سلول ها با استفاده از سانتریفوژ جدا شده و به مدت 1 شب در دماي-2 0 درجه سانتی گراد نگهداري شدند . همچنین به منظور تولید پروتئین از طریق خارج سلولی قطعهDNA لازم براي تولید پروتئین طبق دستور العمل سیستم RTS و از دو طریق تولید شد.
بدین ترتیب که در روش اول ژن مورد نظر در وکتور بیانیPIVEX2.3 d کلون شد و در روش دوم از طریق فاکتورهاي لازم براي انجام رونویسی و ترجمه به ژن افزوده شد . سپس هر یک از این قطعات تولید شده به طور جداگانه به سایر عوامل براي انجام رونویسی و ترجمه - شامل عصاره باکتريE.coli اسید هاي آمینه و منابع انرژي - افزوده شدند. تولید پروتئین به طریقه خارج سلولی با واکنش وسترن بلات و با استفاده از آنزیم مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و بحث
بررسی توالی ژن پروتئین سطحی ایزوله هاي مختلف ویروس نزدیکی این ایزوله ها از نظر فیلوؤنی را نشان می دهد. نتیجه وسترن بلات براي واکنش تولید پروتئین از طریق خارج سلولی تایید کنننده ي تولید پروتئین مورد نظر بود بنابراین تولید خارج سلولی پروتئین هم می تواند به عنوان یک جایگزین سریع و کم زحمت براي تولید داخل سلولی مطرح باشد . آنالیز نمونه هاي پروتئینی استخراج شده از سلول ها ، قبل و بعد از القاي بیان پروتئین به وسیله SDS-PAGE نشان داد که پروتئین مورد نظر بعد از القا به میزان زیاد تولید می شود اما به علت تولید بیش از حد و پیدا نکردن شکل سه بعدي طبیعی به صورت inclusion body در می آید و حالت نامحلول دارد.
چون هدف نهائی از تولید پروتئین تزریق به خرگوش و تولید آنتی بادي پلی کلونال است این پروتئین در حالت غیر طبیعی هم می تواند پاسخ ایمنی مورد نظر را ایجاد کند.بنابراین خالص سازي پروتئین در همان حالت غیر طبیعی صورت گرفت . نمونه هاي حاصل از مراحل مختلف خالص سازي توسط SDS-PAGE بررسی شدند و نتیجه نهائی به دست آوردن پروتئین مورد نظر با خلوص بسیار بالا بود.
