بخشی از مقاله
درتکثیرگیاهان جنبه بسیارمهم حفظ صحت ماده ژنتیکی نسبت به گیاه والد می باشد .بااین وجود مشخص شده که درتکنیک هاي کشت in vitro تغییرپذیري ماده ژنتیکی دیده میشودکه تنوع سوماکلونال نام گرفته است.کشت بافت گیاهی ودرنهایت تنوع سوماکلونال به عنوان یکی ازمنابع القاکننده تنوع ژنتیکی درگیاهان در نظرگرفته میشود.تنوع سوماکلونال،تنوعی است که اغلب به صورت تاثیرات اپی ژنتیک ظاهر میشود،ولی این روش هم چنین باعث تغییراتی درگیاهان شده که این گیاهان توانسته اند این خصوصیات رابه نسل بعد انتقال دهند. تنوع سوماکلونال احتمالا بازتابی از پاسخ گیاه به شرایط استرس زا هم می تواند باشد،بنابراین شناخت مکانیسم هاي تنوع کشت بافت براي مشخص کردن مکانیسم هاي سلولی درگیر در فرآیندتکامل و پاسخ به استرس مفیدخواهدبود.چندین استراتژي براي آشکارکردن این تنوع ژنتیکی وجوددارد ازجمله:شناسایی فنوتیپی،آنالیزسیتولوژیکی وتکنیک هاي آنالیز.DNAدراین یررسی تنوع مورفولوژیکی و ژنتیکی سه رقم پنبه تتراپلوئید شامل رقم هاي MehrوSindoseوهیبریدآنها Mehr*Sindose F1وگیاهان باززایی شده آنهادرواکشت هاي مختلف بررسی شده است.گیاهان باززایی شده به صورت معنی داري ازلحاظ خصوصیات مورفولوژیکی مانند طول ساقه متفاوت بودند 9.آغازگز ISSRبراي بررسی مولکولی استفاده گردید که در کل 96باند - لوکوس - حاصل شد ودراین میان 93باند پلی مورف بوده اند.واکشت هاي مختلف سطوح متفاوتی از تنوع ژنتیکی رادر ارقام مطالعه شده تولید کرده اند.این مطالعه نشان میدهد که ژنوتیپ هاي مختلف پنبه ازلحاظ میزان تنوع سوماکلونال متفاوت بوده اند و درهر ژنوتیپ یک واکشت خاص بالاترین میزان تنوع رابه خوداختصاص داده است.
کلمات کلیدي: پنبه ‚ تنوع سوماکلونال‚تنوع ژنتیکی.ISSR ‚
مقدمه:
پنبه بی اغراق مهم ترین گیاه لیفی و ازمیان گیاهان لیفی قدیمی ترین آنهاست. به علت کشت مداوم وانتخاب مصنوعی ارقام پنبه‚ تنوع ژنتیکی موجود کاهش یافته ومنجر به فرسایش ژنتیکی و از دست رفتن احتمالی لوکوسهاي ژنتیکی شده که نتیجه آن آسیب پذیري درمقابل آفات وبیماریهاست - Sheidai et al., 2008; Van .Esbroeck and Bowman, 1998 - باتوجه به نیاز روز افزون جوامع بشري به بالا بردن کمیت وکیفیت محصولات زراعی امروزه روشهاي ساده به نژادي مثل معرفی کردن - - introductionوانتخاب - selection - کافی نیست ولازم است از طریق تکنیک هاي جدید مانند کشت بافت ژنوتیپ هاي جدید با خصوصیات مطلوب ومورد نیاز بوجودآیند.کشت سلول وبافت شامل کشت سلول یاقطعات جداشده بافت گیاهی برروي یک محیط کشت غذایی وتحت شرایط استریل شده است که در نهایت این کشت ها به گیاهان کاملی باززایی می شوند.
زمانی که کشت بافت به مدت طولانی صورت میگیرد وهورمونهاي گیاهی معینی اثرنمایند‚احیانا تغییراتی در ژنوم پدید می آید.بدین ترتیب این گونه گیاهان باززایی شده با اینکه از یک ژنوتیپ سرچشمه می گیرند‚همیشه بایکدیگر مشابهت ندارند ویک تنوع جدید را نشان می دهند . از آنجاییکه این تغییرات در سلولهاي داراي منشا سوماتیکی رخ میدهد ‚این تغییرات تحت نام تغییرات سوماکلونال شناخته می شوند.تنوع سوماکلونال می تواند برا ي بهبودژنتیکی پنبه مورداستفاده قراربگیرد - . - Zhang,2001 تکنولوژي کشت بافت و بکارگیري فنون آن بعضی از موانع پیش روي به نژادي گیاهان را برطرف کرده است. دراین یررسی تنوع مورفولوژیکی و ژنتیکی سه رقم پنبه تتراپلوئید شامل رقم هاي MehrوSindoseوهیبریدآنها Mehr*Sindose F1وگیاهان باززایی شده آنها درواکشت هاي مختلف بررسی شده است.
موادوروشها:
سه رقم پنبه تتراپلوئید شامل رقم هاي MehrوSindose وهیبرید آنها Mehr*Sindose F1دراین مطالعه استفاده شد.سطوح بذرها با اتانول %70به مدت 2دقیقه ضدعفونی شده وسپس با محلول هیپوکلریت به مدت 30ثانیه تیمارشدند.سرانجام 3-4مرتبه با آب استریل شست وشوشده ونهایتا روي محیط کشت MSحاوي هورمون zeatinقرارگرفتند.کشت ها تحت دوره نوري 16ساعته وباشدت نور 3000Luxدردماي 28درجه سانتی گرادقرارگرفتند.بعداز 25روز واکشت دادن نمونه ها روي محیط کشت جدید صورت گرفت.DNAبرگهاي گیاهان باززایی شده درواکشت هاي 1و2و3ازطریق روش CTABاستخراج گردید - . - De La Rosa et al , 20029آغازگرISSRاستفاده گردیدشامل: - GA - 9A , - GA - 9C UBC810, UBC811, UBC823, UBC834,UBC849, UBC-807و. - GA - 9T ترکیب واکنش PCRشامل 1 ngDNA الگومخلوط آماده dNTP که حاوي هر چهار نوکلئوتید هر یک به غلظت 10mM،کلرید منیزیم - Mg Cl2 - با غلظت 100mM وآنزی م TaqDNA polymerase با غلظت 500 U - 5U/µl - همراه با بافر PCR باغلظت 10X حاوي KCl با غلظت500mM و Tris-HCl با غلظت 100mM و pH 8 می باشد.
وبرنامه دمایی آن به صورت زیر می باشد: 94° Cبراي 45, 5 minچرخه شامل 94° Cبراي 50° C, 30 sبراي72° C, 1 minبراي1 minونهایتا 72° Cبراي .7 min محصولات PCRروي ژل آگارز%1.5 همراه با بافر - 44.5 Mm Tris/Borate, 0.5 X TBE 0.5 Mm EDTA, pH 8.0 - تفکیک شده وسپس ژلها با محلول اتیدیوم بروماید زیر نور UVرنگ آمیزي شده اند. - - Sambrook et al., 2001 سایزمارکر - 1K bp DNA ladder - GeneRuler, Fermentas به عنوان استاندارد استفاده شد.نهایتا کد گذاري داده ها به صورت دوتایی - حضور یا عدم حضور باندها - انجام گرفت و شاخص هاي ژنتیکی متفاوتی براي بررسی و مقایسه ژنوتیپ ها استفاده شد.
نتایج وبحث:
9آغازگر ISSRتوانستند درکل 96باندیالوکوس تولیدکنند که ازاین تعداد 93باندپلی مورف بوده وتنها 3باند مونومورف وجودداشته است.میانگین میزان پلی مورفیسم%96.51بوده است.آغازگرUBC-807وUBC-810بهترتیب باتعداد17و6 باند بیشترین وکمترین تعداد باند را تولید کرده اند. بیشترین میزان باندهاي پلی مورف مربوط به آغازگر UBC-807بوده وکمترین میزان به آغازگز - GA - 9Aبادرصد %77.7اختصاص دارد.درکل7بانداختصاصی تولید شدکه UBC-811با 3باندبیشترین تعدادرا به خوداختصاص داده است.که این باندهاي اختصاصی در شناسایی وتفکیک ژنوتیپ ها مفیدخواهدبود.آنالیز مورفولوژیکی وجوداختلاف معنی داري را از لحاظ طول ساقه بین واکشت هاي هر سه رقم نشان داده است.تعدادي از باندها در ژنوتیپ هاي والدي حضور داشته اند،ولی درگیاهان باززایی شده واکشت هاي مختلف غایب بوده اند .
حضور باندهاي اختصاصی نشان دهنده حضورلوکوس خاصی در ژنوتیپ مطالعه شده است درحالی که عدم حضور آن درواکشت هاي بعدي،نشان دهنده تغییرات ژنتیکی است که درطی واکشت دادن به عنوان نتیجه اي از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده است . - Sheidai,2008 - بنابراین شرایط کشت بافت میزان متفاوتی از تغییرات ژنتیکی را درگیاهان باززایی شده مختلف القاکرده است.به نظر میرسد تغییرات ژنتیکی القاشده درگیاهان باززایی شده با افزایش دوره واکشت افزایش می یابد.این مطالعه نشان میدهد که ژنوتیپ هاي مختلف پنبه ازلحاظ میزان تنوع سوماکلونال متفاوت بوده و درموردهرژنوتیپ یک واکشت خاص بالاترین میزان این تنوع راداشته است.منبع ریز نمونه به عنوان یکی از مهم ترین متغیرهاي تنوع سوماکلونال در نظر گرفته میشود.پیشنهاد میشود منابع متفاوتی براي ریزنمونه درپنبه بکارگرفته شود و میزان تنوع سوماکلونال به دست آمده مقایسه شود .هم چنین می توان کشت بافت را براي القاخصوصیات مورفولوژیکی جدیدي درپنبه استفاده کرد که براي برنامه هاي زادآوري مفید می باشد.
