بخشی از مقاله
چکیده
چندشکلی حاصل از تکثیر نواحی بین توالیهاي ریزماهواره و رتروترنسپوزون - REMAP - از نشانگرهاي مبتنی بر PCR ساده و جدیدي است که مناطق رتروترنسپوزونی و ریزماهوارهاي را مورد هدف قرار می دهد. در این مطالعه به منظور توسعه نشانگرهاي رتروترنسپوزونی REMAP جهت مطالعه تنوع ژنتیکی در یونجه هاي زراعی، 48 ترکیب آغازگري REMAP حاصل از خانواده هاي رتروترنسپونی Tms1Ret1، LORE1، LORE2 وTps12a و توالیهاي ریزماهواره براي ارزیابی تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتی هشت جمعیت 80 - ژنوتیپ - یونجه زراعی مورد استفاده قرار گرفت. 14 ترکیب آغازگري مکان هاي چندشکل و قابل نمره دهی تولید کردند. در کل با استفاده از 14 ترکیب آغازگري REMAP، 119 مکان تکثیر شد که 62 مکان چندشکل بودند. تجزیه کلاستر به روش UPGMA و بر اساس ضرایب فاصله ژنتیکی نی جمعیت ها را در سه خوشه اصلی قرار داد. فاصله ژنتیکی بین جمعیت ها از 0/048 - قره یونجه ملک کندي و بغدادي - تا 0/124 - بغدادي و آذربایجان اردوبار - متغیر بود. تجزیه واریانس مولکولی، تنوع ژنتیکی زیادي را در درون جمعیت ها 94 - درصد - نسبت به بین جمعیت ها 6 - درصد - نشان داد. درصد مکانهاي چند شکل در جمعیت ها از 79/03 - جمعیت محلی اصفهان - تا 87/71 - جمعیت قره یونجه ارومیه - متغیر بود و میانگین هتروزیگوسیتی براي جمعیت هاي مورد مطالعه برابر0/267 بود. نتایج نشان داد که تمام خانواده هاي رتروترنسپونی مورد استفاده در نزدیکی ریزماهواره ها در ژنوم یونجه حضور داشته و میتوانند به عنوان نشانگرهاي REMAP در یونجه استفاده شوند.
واژه هاي کلیدي: یونجه تتراپلوئید - - Medicago Sativa؛ تجزیه واریانس مولکولی؛ تنوع ژنتیکی
مقدمه
یونجه زراعی - . - Medicago Sativa L در بین نباتات علوفه اي به علت خوش خوراکی و غنی بودن از مواده پروتئینی و معدنی به عنوان مهم ترین گیاه علوفه اي دنیا محسوب می شود. امروزه آگاهی ازسطح تنوع ژنتیکی و برآورد میزان آن در ژرم پلاسم گیاهی و تعیین روابط ژنتیکی مواده اصلاحی، پایه واساس بسیاري از برنامه هاي اصلاح نباتات می باشد که به علت محدودیت تعداد نشانگرها وتاثیر عوامل محیطی و مراحل رشدي گیاه بر نشانگرهاي مورفولوژیکی و پروتئینی، امروزه نشانگرهاي مبتنی بر DNA به عنوان ابزارهاي کارا و مکمل براي تعیین سطح تنوع وتعیین روابط ژنتیکی ژنوتیپ هاي گیاهی استفاده می شوند. از نشانگرهاي مولکولی مختلفی براي ارزیابی تنوع ژنتیکی در یونجه استفاده شده است، در این راستا کیوانی و همکاران 26 - 4 -
جمعیت زراعی ایران را با استفاده از نشانگرهاي 1AFLPمورد مطالعه قرار دادند و به کمک تجزیه کلاستر جمعیت هاي مورد مطالعه را در 4 گروه اصلی گروه بندي کردند. با این حال تا کنون گزارشی مبنی بر استفاده از نشانگرهاي 2REMAP در یونجه یافت نشده است. با توجه به اینکه خاستگاه یونجه ایران است و تهیه ارقام اصلاح شده جهت مرتفع ساختن کمبود علوفه کشور امري ضروري به حساب می رود، هدف این تحقیق بر بررسی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیت هاي یونجه با استفاده از نشانگرهاي REMAP قرار گرفت.
مواد وروش ها:
مواد گیاهی و استخراج :DNA مواد گیاهی شامل 80 ژنوتیپ از 8 جمعیت یونجه 10 - گیاه از هر جمعیت - بود. جمعیت هاي استفاده شده شامل قره یونجه ارومیه، قره یونجه ملک کندي، محلی اصفهان، بغدادي و همدانی ازایران، آذربایجان اردوبار از آذربایجان، ترکیه ا و ترکیه ساکوئل از ترکیه بودند. از گیاهچه هاي 25 روزه DNA ژنومی با استفاده از روش آسوبل و همکاران - 2 - با تغییرات جزئی استخراج شد و براي تعیین کمیت وکیفیت DNA از دستگاه اسپکتروفوتومتر - ساخت شرکت اپندورف آلمان - و الکتروفورز DNA در ژل آگارز 0/8 درصد استفاده شد
واکنش هاي 48 :REMAP ترکیب آغازگريREMAP حاصل از ترکیب 4 تک آغازگر Tps12a - 3IRAP، LORE2، LORE1 و - Tms1Ret1 با 12 آغازگر A7 - ISSR، A12، B1، 438، 443، 459، 818، 852، 840، 848، 849 و - 857 روي 4 ژنوتیپ یونجه مورد آزمایش قرار گرفت تا ترکیبات آغازگري که الگوي باندي واضحی دارند براي واکنش هاي REMAP انتخاب شوند - جدول . - 1 واکنش هاي زنجیره اي پلیمراز در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام گرفت. برنامه دمایی واکنش زنجیره اي پلیمراز، الکتروفورز و رنگ آمیزي فرآورده هاي تکثیري طبق روش عبدالهی و همکاران - 1 - صورت گرفت با این تفاوت که دماي اتصال براي تمام ترکیبات آغازگري برابر 52 درجه سانتیگراد بود. تجزیه و تحلیل داده ها:. ماتریس وجود و عدم وجود باند 1 - و - 0 براي محاسبه ضرایب فاصله ژنتیکی نی بین جمعیتها استفاده گردید. تجزیه واریانس ملکولی - Analysis of molecular variance - - AMOVA - میانگین هتروزیگوسیتی و درصد مکان هاي چندشکل براي هر جمعیت با استفاده از نرم افزار GenALEx6 نسخه 6 محاسبه شد. رسم دندروگرام و تجزیه کلاستر با روش UPGMA مبتنی بر ضرایب فاصله ژنتیکی نی با استفاده از نرم افزار NTSYS نسخه 2/02 انجام گرفت.
نتایج وبحث:
درکل 48 ترکیب آغازگري REMAP براي ارزیابی تنوع ژنتیکی در هشت جمعیت یونجه استفاده شد که از این تعداد، 11 ترکیب آغازگري Ret1-459 - ، Ret1-a12، Ret1-438، Ret-818، Ret1-825، LORE1-840، LORE1-848، LORE2-849، LORE2-857، Tps12a-459 و - Tps12a-438 مکان هاي چندشکل و قابل نمره دهی تولید کردند. سه ترکیب آغازگري Ret1-a7 - ، Ret1-B1 و - Ret1-443 نیز باندهاي قابل نمره دهی ولی فاقد چندشکلی تکثیر کردند . مابقی ترکیبات آغازگري مورد استفاده الگوي باندي واضحی تولید نکردند و بنابراین در تجزیه نشانگرهاي REMAP مورد استفاده قرار نگرفتند. شکل1 .الگوي باندي مربوط به ترکیب آغازگري 10 - LORE1-848 نمونه اول از سمت راست مربوط به جمعیت ترکیه ساکوئل و 10 نمونه دوم مربوط به جمعیت قرهیونجه ملک کندي میباشد - .
ایجاد باندهاي REMAP توسط خانواده هاي رتروترنسپوزونی بیانگر حضورخانواده هاي رتروترنسپوزونی مورد مطالعه در نزدیکی ریزماهواره ها می باشد. حضور خانواده هاي رتروترنسپوزونی در نزدیکی ریزماهواره ها اخیرا در جو هم گزارش شده بود . - 5 - ترکیب آغازگري Tps12a-459 از بین ترکیبات آغازگري استفاده شده بیشترین تعداد باند و بیشترین تعاد باند هاي چند شکل را داشت. 14 ترکیب آغازگري در مجموع 119 مکان را تکثیر کردند که از این تعداد 62 مکان 52 - درصد - چند شکل بودند. میانگین تعداد مکان هاي چندشکل براي هر آغازگر برابر 4/42 بوددامنه. باندهاي تکثیر شده از75 جفت باز تا 2500 جفت باز متغیر بود. بر اساس ضرایب فاصله ژنتیکی نی، فاصله جمعیت ها از 0/048 - بین جمعیت هاي قره یونجه ملک کندي و بغدادي - تا 0/124 - بین جمعیت هاي بغدادي و آذربایجان اردوبار - متغیر بود. میانگین فاصله ژنتیکی بین جمعیت ها برابر با 0/089 بود. تجزیه کلاستر به روش UPGMA و بر اساس ضرایب فاصله ژنتیکی نی جمعیت هاي مورد مطالعه را در 3 گروه اصلی قرار داد - شکل . - 2
