بخشی از مقاله
چکیده
فاکتور رشد شبه انسولین باند شونده به ژن پروتئین - IGFBP-3 - 3 ژن ساختاري مسئول اعمال چند گانه سیستم فاکتور رشد شبه انسولین است که از نظر تکاملی حفاظت شده است. این مطالعه براي تعیین تنوع ژنتیکی بز کرکی راینی با استفاده از دو نشانگر XspI-RFLP و HaeIII-RFLP براي جایگاه IGFBP-3 بز انجام شد. نمونه هاي خون کامل از 100 بز نر و ماده به تصادف جمع آوري شدند. در آنالیز PCR-RFLP با Hae III، فراوانی هاي ژنوتیپ هاي H1H1، H1H2 و H2H2 بزها به ترتیب 0/69، 0/22 و 0/09 و فراوانی هاي ژنوتیپ هاي X1X1، X1X2 و X2X2 بزها به ترتیب 0/22، 0/24 و 0/54 بود. شاخص شانون، شاخص نئی، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و هتروزیگوسیتی مورد انتظار به ترتیب 0/50، 0/32، 0/22 و 0/32 براي HaeIII RFLP و 0/64، 0/44، 0/24 و 0/45 براي XspI RFLP محاسبه شدند. می توان نتیجه گرفت که بز کرکی راینی تنوع ژنتیکی بالایی دارد. ژن IGFBP-3 می تواند به عنوان ژن کاندیدا براي انتخاب بر اساس نشانگر - MAS - در نژادهاي بز به کار گرفته شود.
مقدمه
بز کرکی رائینی یکی از مهمترین نژادهاي بز در ایران است که به واسطه تولید کرك مرغوب و کیفیت بالا از ارزش اقتصادي بالایی در بازارهاي جهانی برخوردار است و زیستگاه اصلی این حیوان در استان کرمان و شهرستان بافت میباشد. در ایستگاه اصلاح نژاد بز کرکی رائینی پرورش و توزیع بزهاي نر انتخابی در بین دامداران مهمترین هدف بوده و انتخاب دامها بر اساس رنگ کرك بدن و فنوتیپ ظاهري انجام و بزهاي رنگی از گله حذف میشوند. اگرچه انتخاب بر اساس رنگ کرك موجب یکنواختی و بازارپسندي کرك میگردد، ولیاحتمالاً باعث کاهش تولید در صفات دیگر میشود.
در سالهاي گذشته هیچگونه برنامه مدون اصلاح نژادي، ارتباط منطقی با دامداران، انتخاب دامهاي برتر و پرورش دامهاي ممتاز و تبادل آنها که موجب بالا رفتن فراوانی ژنهاي مطلوب در گلههاي مردمی میشود وجود نداشته است. برنامههاي اصلاحنژادي بیشتر در جهت بهبود وضعیت تولیدي حیوانات اهلی عمل میکنند که توفیق این برنامهها به میزان تنوع ژنتیکی موجود در گله بستگی دارد. تنوع ژنتیکی در داخل و یا بین جمعیتها بدون در نظر گرفتن تعداد آلل در هر جایگاه ژنی، جهش، انتخاب، مهاجرت و روشهاي تولیدمثلی محاسبه میشود و به عنوان یک ابزار ارزشمند در برنامههاي اصلاح نژادي مورد استفاده قرار میگیرد.
- Nagamine and Higuchi، . - 2001 ژن - Insulin-like growth factor binding protein-3 - IGFBP-3 یک ژن ساختاري است که مسئول اثرات چندگانه سیستم - Insulin-like growth factor - IGFs است. سیستم سگنال دهنده IGFs که شامل IGF-I، IGF-II، رسپتور IGF-II و شش پروتئین باند شونده IGFBP-1 - تا - IGFBP-6 می باشد، نقش مهمی در تکامل، رشد، تولید مثل و پیري بازي می کند . - Duan & Xu, 2005 - چند شکلی هاي IGFBP-3 گاوي و ارتباط آن با صفات تولید مثلی در گاو بررسی شده است.
- Sun, 2002 - چند شکلی هاي IGFBP-3 بوفالو نیز گزارش شده است . - Kumar et al., 2004 - در اگزون 2، اینترون 2، اگزون 3 و اینترون 3 ژن IGFBP-3 گوسفند با روش PCR-RFLP چند شکلی هاي مشابهی یافت نشده است . - Kumar et al., 2006 - اما، چند شکلی هایی براي این ژن در بز با روش PCR-RFLP گزارش شده است - Lan . - et al., 2007 متاسفانه بزهاي ایران و به ویژه بز کرکی راینی تا کنون براي این ژن با روش هاي ملکولی مورد مطالعه قرار نگرفته است. لذا، هدف این تحقیق بررسی پلی مورفیسم ژن IGFBP-3 در بز کرکی راینی براي اولین بار می باشد.
مواد و رو ش ها
نمونههاي خون کامل از سیاهرگ وداج گردن و با استفاده از لوله خلاء دار 5 میلی لیتري حاوي ماده ضد انعقاد EDTA از 100 رأس دام تهیه شده و در داخل یخ به آزمایشگاه منتقل گردید تا از آن ها DNA استخراج شود. استخراج DNA از نمونههاي خون کامل به روش بهینه شده و تغییر یافته استخراج نمکی1 انجام گردید. در این مطالعه، جایگاه IGFBP-3 مورد استفاده قرار گرفت. آغازگرهاي جفت اول F: 5-GAA ATG GCA GTG AGT CGG-3 و R: 5-TGG GCT CTT GAG TAA TGG TG-3 براي تکثیر قطعه 316 جفت بازي از اگزون 2 ژن IGFBP-3 و آغازگرهاي جفت دوم F: 5-CCA AGC GTG AGA CAG AAT AC-3 و R:5-AGG AGG GAT AGG AGC AAG TT-3 براي تکثیر قطعه 655 جفت بازي از اینترون 2، اگزون 3، اینترون 3 ژن IGFBP-3 استفاده شدند. انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز با استفاده از PCR Master Kit شرکت سینا ژن انجام شد. جهت انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز برنامه مورد استفاده به صورت زیر بود:
الف - براي جفت اول:
-1 دناتوراسیون اولیه 4 دقیقه 1-T= 95ºC
-2 دناتوراسیون 45 ثانیه 2- T= 94ºC
-3 اتصال 45 ثانیه 3- T= 63ºC
-4 سنتز 1 دقیقه 4- T= 72ºC 35 سیکل
-5 سنتز نهایی 10 دقیقه 5- T= 72ºC
ب - براي جفت دوم:
-1 دناتوراسیون اولیه 4 دقیقه 1-T= 95ºC
-2 دناتوراسیون 45 ثانیه 2- T= 94 ºC
-3 اتصال 45 ثانیه 3- T= 60 ºC
-4 سنتز 1 دقیقه 4- T= 72 ºC 35 سیکل
-5 سنتز نهایی 10 دقیقه 5- T= 72 ºC
پس از اطمینان از انجام PCR به میزان 20 میکرولیتر از محصولات PCR ژن IGFBP-3 که اندازه آنها 316 جفت باز بود با 10 واحد از آنزیم Hae III درون میکروتیوب مخلوط شد و به مدت 5 ساعت در دماي 37 درجه قرار داده شدند تا هضم آنزیمی انجام شود. براي محصولات PCR ژن IGFBP-3 که اندازه آنها 655 جفت باز بود از آنزیم Xsp I با همان شرایط هضم آنزیمی استفاده شد. پس از آنزیم زدن محصولات آنها روي ژل برده شدند.
سپس ژل به دستگاه ژل documentation انتقال داده و از آن عکس گرفته شد. پس از اتمام کارهاي آزمایشگاهی و تعیین ژنوتیپ تمام نمونه ها، شمارش ژنوتیپ ها و تعیین فراوانی آللی، هتروزایگوتی و هموزایگوتی مشاهده شده مورد بررسی قرار گرفت که این کار توسط نرم افزار Pop Gene32 صورت گرفت. سپس تنوع ژنتیکی با معیارهایی همچون هتروزیگوسیتی مورد انتظار، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و شاخص شانون محاسبه شدند.
نتایج و بحث
مشاهده تنها یک باند 316 جفت بازي براي جفت پرایمر اول و یک باند 655 جفت بازي براي جفت پرایمر دوم نشان دهنده تکثیر درست قطعات انتخاب شده ژن IGFBP-3 و صحت انجام PCR بود که با نتایج بدست آمده از تحقیق Lan و همکاران - 2007 - مطابقت داشت. نتیجه هضم محصولات PCR ژن IGFBP-3 توسط آنزیم هاي برشی Hae III و Xsp I به این ترتیب بود که ژنوتیپ H1H1 داراي یک باند 264 جفت بازي است - البته دو باند 44 و 8 جفت بازي هم دارد که در شکل دیده نشدند - ، ژنوتیپ H2H2 داراي یک باند 195 جفت بازي است - البته سه باند 69، 44 و 8 جفت بازي هم دارد که دیده نشدند - و ژنوتیپ H1H2 داراي دو باند 264 و 195 جفت بازي است - البته سه باند 69، 44 و 8 جفت بازي هم دارد که دیده نشدند - . ژنوتیپ X1X1 داراي یک باند 655 جفت بازي - بدون برش - ، ژنوتیپ X2X2 داراي دو باند 421 و 234 جفت بازي و ژنوتیپ X1X2 داراي سه باند 655، 421 و 234 جفت بازي - هتروزیگوت - بود.
مقایسه باندهاي موجود در نمونه هاي هضم شده توسط این آنزیم ها با نشانگر اندازه نشان داد که قطعات موجود روي ژل با آن چه که از روي توالی DNA ژن IGFBP-3 پیش بینی می شد، یکسان می باشد و با نتایج بدست آمده از تحقیق Lan و همکاران - 2007 - مطابقت داشت. فراوانی هاي ژنوتیپی و ژنی براي جایگاه IGFBP-3 در جدول 1 و 2 داده شده است. فراوانی هاي ژنی و ژنوتیپی به دست آمده در این تحقیق براي آلل هاي H1 و H2 مشابه این فراوانی ها براي بزهاي کرکی Inner Mongolia White Cashmere - IMWC - به دست آمده در تحقیق Lan و همکاران - 2007 - بود 0/82 - و 0/18 به ترتیب براي آلل هاي H1 و - H2، اما با فراوانی هاي بزهاي شیري و گوشتی به دست آمده در تحقیق Lan و همکاران - 2007 - متفاوت بود.
