بخشی از مقاله
چکیده
پسته - Pistacia vera L. - یکی از مهمترین محصولات باغی در ایران است. در این پژوهش جداسازي و تعیین مشخصات 12 نشانگر ریزماهواره جدید که از کتابخانه ژنومی غنی از توالی تکراري P. vera L. انجام شده است. کارایی 12 نشانگر ریزماهواره جدید پسته توسط 45 رقم پسته زراعی بررسی شد. تعداد آللهاي چند شکل از 2 تا 4 - با میانگین - 2/75 و محتواي اطلاعات چند شکل از 0/19 تا - 0/56 با میانگین - 0/35 مشاهده شد. نتایج این تحقیق نشان داد نشانگرهاي ریزماهواره جدید قابلیت کاربرد در مطالعات مرتبط با ساختار جمعیت و تنوع ژنتیکی پسته را دارا می باشند.
کلمات کلیدي: پسته - Pistacia vera L. - ، نشانگر ریزماهواره
مقدمه
پسته - Pistacia vera L. - از مهمترین محصولات کشاورزي کشور است که از جنبه هاي مختلف اقتصادي ، اجتماعی، زیست محیطی اهمیت فوق العاده اي دارد. علی رغم جایگاه ممتاز کشور در تولید پسته در جهان، اطلاعات دقیقی از تنوع و اصالت ژنتیکی و حفظ حقوق مالکیت این ذخایر توارثی گرانبها در کشور وجود ندارد. پازوکی و همکاران - 3 - و صالحی شانجانی و همکاران - 5 - با مطالعه ژنوتیپ هاي متعلق به ارقام تجاري ایرانی و خارجی - Pistacia vera - همراه با گونه هاي وحشیP. atlantica subsp. Kurdica و P. khinjuk با استفاده از نشانگرهاي ریزماهواره و AFLP تنوع ژنتیکی درون و بین گونهاي و ارتباطات فیلوژنتیکی بین گونههاي Pistacia و ارزیابی ارتباطات ژنتیکی بین ارقام داخلی و خارجی را موردبررسی قرار گرفتند.
مطالعات مختلف خوشه بندي بطور آشکاري گونههاي مختلف پسته و همچنین ارقام ایرانی و خارجی P. vera را از هم تفکیک نمودند. اکثر ارقام ایرانی با استفاده از هر دو نشانگرهاي ریزماهواره و AFLPکاملاً ازیکدیگر جدا شدند. در حال حاضر با استفاده از روشهاي نوین بیوتکنولوژي امکان انگشت نگاري ارقام مهم زراعی پسته ایران بر اساس مولکول DNA تحت عنوان "انگشت نگاري "DNA میسر شده است.ریزماهواره ها به عنوان نشانگر منتخب جهت انگشت نگاري ژنتیکی و مطالعات تنوع ژنتیکی در درختان میوه به دلیل سطوح بالاي چند شکلی، میزان بالاي تکرار پذیري و قابل اعتماد بودن آنها و مدل هم بارزي وراثت در نظر گرفته میشود و به طور گسترده براي شناسایی ارقام و تهیه نقشه ژنتیکی استفاده می شوند 12 . - 3 - نشانگر ریزماهواره اولین بار توسط احمد و همکاران - 1 - جداسازي و تعیین مشخصات شدند. هدف این تحقیق جداسازي و تعیین مشخصات نشانگر ریزماهواره از رقم اکبري پسته - Pistacia vera - بود.
مواد و روشها
به منظور جداسازي قطعات ریزماهواره رقم اکبري پسته - Pistacia vera - انتخاب شد. DNA ژنومی از برگها ي جوان استخراج گردید. جداسازي ریزماهواره ها بااستفاده از روش فیاسکو - 8 - ، انجام شد. هضم DNA و انتخاب قطعات کوچک بااستفاده ازآنزیم Tru1I - Fermentas - انجام شد. سازگارسازهاي متناسب با مکان برش آنزیمی طراحی شد و طی واکنش الحاق با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase به قطعات حاصله از هضم الحاق شد.تکثیر قطعات حاصله از هضم آنزیمی با استفاده از آغازگر اختصاصی متناسب با توالی سازگارساز طی دو مرحله انجام شد، محصول واکنش به نسبت 1:15 رقیق سازي شد و 3/75 میکرو لیتر از آن با آغازگر اختصاصی جهت واکنش زنجیره اي پلیمراز مورد استفاده قرارگرفت. بررسی صحت تکثیر قطعات با استفاده از الکتروفورز محصول واکنش در ژل پلی اکریل آمیدواسرشته ساز شش درصد انجام شد.
جداسازي قطعات تکثیر شده حاوي توالی هاي تکرار با استفاده از کاوشگرهاي - ATT - 10، - CTT - 10، - GTG - 10، - GC - 17، - AC - 17، - CT - 17،و - AT - 17 که ابتداي -5′فسفات آنها بایوتینه شده است انجام گرفت. هر یک از محیط هاي واکنش مرحله قبل با 100 پیکومول از هر یک از کاوشگرها مخلوط شده و حجم محیط واکنش با استفاده از بافر هیبریداسیون - 4.2x SSC, 0.07% SDS - به 100 میکرولیتر تعدیل شد. به منظور دورگه سازي کاوشگرها با توالی هاي همتا و تشکیل ساختار هترودوبلکس محیط هاي واکنش در دماي96 ºc به مدت 10 دقیقه نگهداري شده و سپس در دماي آزمایشگاه به مدت 30 دقیقه نگهداري شدند. به هر یک از محیط هاي واکنش 300 میکرولیتر 10mM Tris-cl, pH8; 1mM - TEN100 - EDTA; 100mM NaCl افزوده شد و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون Streptavidin - BioMag®; Qiagen - به محیط واکنش افزوده شده و مدت 30 دقیقه در دماي آزمایشگاه جهت الحاق Streptavidin به بایوتین در ترمومیکسر - با سرعت - 300rpm نگهداري شدند.
بمنظور تخلیص قطعاتی که به تور متناسب به کاوشگرها و Streptavidin اتصال یافته اند، - Complex Streptavidin-probe-DNA - محیطهاي واکنش سه بار با هر یک از بافرهاي TEN100 و 0.2x SSC, 0.1% SDS شستشو شدند پس از آخرین مرحله جداسازي مجموعه - Complex - در میدان مغناطیسی، به هر یک از محیط هاي واکنش 500 میکرولیتر اب دوبار تقطیر استریل افزوده شد و بمنظور واسرشته سازي ساختار هترو دوبلکس در دماي 96 ºc به مدت 10 دقیقه نگاهداري شده و جهت جلوگیري از الحاق مجدد کاوشگرها به قطعات همتا بلافاصله به دماي صفر درجه برده شدند. تخلیص قطعات تک رشتهاي DNA، به عبارتی جداسازي Streptavidin از محلول حاوي قطعات DNA با استفاده از میدان مغناطیسیمجدداً انجام شد و قطعات تک رشتهاي DNA محلول در آب با استفاده از ایزوپروپانول و - Oligos Etc. Inc.,سانتریفیوژ رسوب داده شدند و پس از خشکشدن رسوب کاملاً یغر قابل رویت، در 30 میکرولیتر آب حل شدند.
جهت دورشتهاي سازي و افزایش غلظت، بمنظور همسانه سازي آنها، قطعات تک رشتهاي محلول در آب به واکنش زنجیرهاي پلی مرازي برده شدند، محصول واکنش حاصله پس از رقیق سازي به نسبت 1 به 15، مجدداً به واکنش زنجیرهاي پلی مرازي برده شد. محصول واکنش حاصله همسانه سازي شده و به باکتري E.coli - DH5α - با بهره گیري از روش شوك حرارتی - 7 - انتقال داده شد. با استفاده از روش Blue white selection باکتريهاي کلون مثبت انتخاب شده و به روش انهدام قلیایی پلاسمید آنها استخراج شد. جهت اثبات صحت وجود قطعات DNA همسانه شده، پلاسمید هاي استخراج شده با آنزیم برشی EcoR I مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و قطعات حاصله با استفاده از ژل آگارز یک درصد تفکیک شدندپس. از تاٌیید صحت همسانه سازيمجدداً جهت تخلیص، استخراج پلاسمید از باکتريهاي انتخابی انجام شد و تمام پلاسمیدها جهت توالی یابی قطعات همسانه شده ارسال شدند.
طراحیآغازگرها با استفاده از نرم افزار اُلیگوتکWilsonville, USA - ، از توالی نوکلئوتیدي دوطرف توالی هاي تکرار انجام شده و ساخت آغازگرها توسط شرکت MWG - Eurone, Germany - انجام شد. بمنظور بررسی امکان بهره گیري از آغازگرهاي طراحی شده جهت تعیین میزان تنوع، 45 رقم مختلف پسته انتخاب شده - جدول - 1 و از برگ نمونههاي انتخابی استخراج DNA انجام شد جهت تعیین مناسب ترین دماي الحاق آغازگرها به قطعات همتا در ژنوم، واکنش هاي زنجیرهاي پلی مرازي مختلفی طراحی و مورد آزمون قرار گرفتند. تفکیک قطعات تکثیر شده با بهره گیري از ژل پلی اکریل آمید واسرشته ساز 6 درصد انجام شد. از رنگ آمیزي نیترات نقره بدلیل کیفیت مطلوب تر در این تحقیق استفاده شد . - 2 - قطعات DNA تکثیر شده با وضوح بالا به صورت صفر و یک - یک براي وجود و صفر براي عدم وجود نوار - DNA امتیاز دهی شدند. تجزیه آماري دادههاي حاصله با استفاده از نرم افزار CERVUS,2.0 انجام شد - . - 4 تجزیه داده هاي حاصله از بررسی تشابه ژنومی 45 رقم پسته ایران، به منظور بررسی کارایی نشانگرهاي شناسایی شده با استفاده از نرم افزار NTSYS. 1.80 انجام شد . - 6 -
