بخشی از مقاله
چکیده:
کوجی از اجزای مهم غذاهای تخمیری در شرق آسیا میباشد که توسط گونه های آسپرژیلوس اوریزا، تولید میشود.این پژوهش با هدف بررسی تولید آنزیم آلفاآمیلاز از کوجی انجام گرفته است. برای تولید آنزیم از کپک آسپرژیلوس اوریزاNPUST-FS-206-A1، ترکیبات مختلف از مخلوط سویا و جوانه گندم به عنوان سوبسترا در تهیه و تخمیر کوجی استفاده شده است.در خلال دوره کشت تغییرات pH نمونه مختلف یکسان بود در حالیکه محتوای رطوبتی کوجی کاهش چشمگیری نشان داد.کوجی با محتوای سویای بیشتر فعالیت پروتئازی بیشتری داشته است و نتایج نشان داد که محتوای قندهای احیا در کوجی با میزان فعالیت آمیلاز مرتبط بود. در ضمن بین رشد کپک و تولید آنزیم همبستگی مشاهده شد میکروگراف الکترونی نشان داد اسپورهای کپک پس از 48 ساعت از شروع کشت تشکیل میشوند و بالاترین فعالیت آنزیم ها نیز در این مرحله مشاهده شد. اندازه اسپور کپک آسپرژیلوس اوریزا تاثیری بر تولید آنزیم نداشت. فعالیت آنزیم آلفاآمیلاز در محصول کوجی با محتوای جوانه گندم در مقایسه با سویا بیشتر بوده است و بنابراین استفاده بهینه از مخلوط به عنوان توسعه فعالیت آنزیم آلفاآمیلاز در فرایندهای تخمیری توصیه میشود.
کلمات کلیدی: " آسپرژیلوس اوریزا، آلفا آمیلاز، کوجی"
مقدمه:
بستر کشت جامد - SSF - روش رایج در تخمیر سنتی است .پروسه فرایند روی بستر کشت جامدی با محتوای رطوبتی 0.4 تا 0.9 در شرایط طبیعی و غیر اسپتیک انجام شده است. مواد طبیعی مختلف مورد نیاز مثل گندم ،پوسته برنج و چوب ذرت به عنوان سوبسترای تخمیر مورد استفاده قرار گرفته اند . - 2 - در تخمیر کوجی نیز از بستر کشت جامد استفاده میشود .در مرحله اول تولید غذاهای تخمیری نظیر سس سویا ، میسو، میرین و ساکی انجام میشود . - 3 - در تخمیر سنتی سس سویا ،سویا به عنوان منبع پروتئینی برای کوجی مصرف میشود. کپک کوجی - آسپرژیلوس اوریزا - کربوهیدرات و پروتئین سویا را برای سنتز آنزیم میسازد .
پروتئین های خارج سلولی بسیاری نظیر لوسین امینوپپتیداز، تاکا-آمیلاز - آلفا-آمیلاز - ، اوریزین - آلکالین پروتئاز - ، گلوتامیناز، آلانیل دی پپتیل پپتیداز، ایکس-پرولیل آمینوپپتیداز و متالوپپتیدازاز اثر آسپرژیلوس اوریزا 3.951 روی بستر کشت تولید میشوند . - 4 - به علاوه گندم منبع مناسب نشاسته ای یا کربن در تخمیر کوجی مطرح است . - 5 - فاکتورهای بسیاری نظیر سوبسترا، اندازه مایع تلقیح، محتوای رطوبتی سوبسترا و دمای کشت روی تولید آنزیم تاثیر میگذارند 7 - و. - 6 اگرچه سویا و جوانه گندم از قدیم به عنوان سوبسترا برای تولید سنتی سس سویا مورد استفاده قرار میگیرفته اند ، گزارش های کمی از استفاده ازترکیب این دو ماده برای تولید آنزیم وجود دارد. در این پژوهش تاثیرات ترکیبات مختلف سویا و گندم به عنوان سوبسترا و اندازه مایع تلقیح اسپورهای آسپرژیلوس اوریزا روی تغییرات بیوشیمیایی به خصوص تولید آنزیم حین دوره تخمیر کوجی مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روش ها
اماده سازی کوجی
سویا به مدت 6 تا 8 ساعت در آب خیسانده شده و سپس در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 40 دقیقه اتوکلاوگذاری میگردد. جوانه گندم تا رسیدن به رنگ قهوه ای تیره برشته شده و ترک برداشته میشود سپس 32 درصد از کل جوانه گندم آسیاب شده و پودر آن با محیط کشت با مواد خام مخلوط میشود. ترکیبات مختلف سویا و گندم %40:%60 - ،%50:%50 و - %60:%40 با %0.1 از اسپور کپک تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 72 ساعت انکوبه گذاری میشود. اسپورهای آسپرژیلوس اوریزا NPUST-FS-206-A1 در دو اندازه مختلف % 0.3 . %0.1 وزنی وزنی داخل مواد خام تلقیح میشوند.
استخراج آنزیم
برای استخراج آنزیم ماده تخمیری با فسفات بافر 0.1 مولار - 1:2 w/v - - pH 6.9 - توسط انکوباتو شیکردار - 150 دور بر دقیقه، 30 درجه سانتیگراد، 30 دقیقه - مخلوط میشود. پس از سانتریفوژ در 10000g ،4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه سوپرناتانت به عنوان آنزیم خام استخراجی، جمع آوری میشود.
روش های تجزیه ای
محتوای رطوبتی نمونه ها توسط تعیین رطوبت تعادلی مادون قرمز - FD-720, Kett Electric Laboratory, Tokyo, Japan - تعیین گردید. ماده تخمیری با آب دیونیزه به نسبت 1:2 مخلوط شد و pH توسط پی اچ سنج . - DKK- TOA, HM- 25G, Japan - فعالیت پروتئازهای طبیعی و قلیایی با استفاده از محلول کازئین %0.65 در بافر فسفات 0.05 مولار - pH 6.9 - و بافر کربنات 0.05 مولار - - pH 10 به ترتیب تعیین شدند. یک واحد از فعالیت آنزیم مقداری از آن تعریف میشود که بتواند در هر دقیقه 1 میکروگرم از تیروزین را تحت شرایط آزمایش آزاد کند . - 8 - فعالیت آمیلازی با محلول نشاسته % 1. 0 در بافر سدیم استات 0.1 مولار - - pH 5.0 اندازه گیری شد. یک واحد از فعالیت آنزیم مقداری از آن تعریف میشود که بتواند در هر دقیقه 1 میلی مول از قندهای احیا را از مالتوز تحت شرایط آزمایش آزاد کند . - 6 - محتوای قندهای احیا توسط روش 3و-5دی نیتروسالیسیک اسید اندازه گیری شد - . - 9 همه نمونه ها در سه تکرار آنالیز شدند.
نتایج و بحث
ویژگی های فیزیکی
pH های آغازین تیمارهای مختلف همگی در حدود 6.32 بودند، پس از سپری شدن 36 ساعت از تخمیر، pH رو به کاهش گذاشت - . - 1 نتایج نشان داد نمونه های کوجی با محتوای %60 سویا بالاترین میزان pH را تا 6.97 تا 72 ساعت پس از کشت نشان میدهند. افزایش pH به علت تولید پروتئین های خارج سلولی از آسپرژیلوس اوریزا حین تخمیر کوجی بوده است . - 4 - از طرف دیگر محتوای رطوبتی با سپری شدن از زمان تخمیر کاهش نشان داد و مقدار آن از %35-40 به %19-22 در مدت 72 ساعت از شروع تخمیر در هر سه نمونه ترکیبی رسید . - 1 - نمونه دارای مقادیر بالای سویا بالاترین محتوای رطوبتی را در آغاز داشته است .
کاهش محتوای رطوبتی به علت رشد میسلای کپک آسپرژیلوس اوریزا حین تخمیر بوده است. به علاوه نم زدن از طریق تسهیل نفوذ میسلا به داخل سوبسترا ،aw مناسب را برای رشد کپک فراهم میکند . - 10 - این گفته در مغایرت با پژوهش کوت مانوپ و همکاران - 6 - میباشد که گزارش کردند محتوای رطوبتی گندم و برنج تخمیر شده حین سپری شدن از زمان تخمیر افزایش میابد . این اختلاف نتیجه ممکن است به علت سوبسترای متفاوت باشد . ذرات سویا نسبت به برنج و گندم دارای اندازه بزرگتری بوده که این مهم چرخش سهل هوا و تاثیر اکشیژن و انتقال گرما روی سوبسترا را میسر میسازد.
تاثیر ترکیبات مختلف سوبسترا روی تولید آنزیم
فعالیت پروتئازی ترکیبات مختلف سوبسترا در آغاز تخمیر مشابه هم بود پس از 24 ساعت در نمونه دارای %60 سویا افزایش سریعی در فعالیت پروتئاز خنثی مشاهده شد و به بالاترین میزان 84.38 واحد بر گرم وزن خشک در 48 ساعت از تخمیر رسیده و سپس کاهش میابد - . - 1 بالاترین فعالیت پروتئازی قلیایی 41.35 واحد بر گرم وزن خشک در 72 ساعت از تخمیر در نمونه دارای % 60 سویا دیده میشود - 1 - در حالیکه هر دو فعالیت پروتئازی قلیایی و خنثی در نمونه های دارای %40 و %50 سویا کمتر بوده است. مطالعات پیشین گزارش کرده اند که برای تولید آنزیم نیاز به آمینواسیدهایی است که در اثر هضم پروتئینهای سوبسترا تولید میشوند. آسپرژیلوس اوریزا میتواند از منبع نیتروژنی موجود در سویا جهت تولید آمینواسید بهره ببرد که سبب کاهش محتوای پروتئینی سویا با پیشرفت کشت میشود 4 - و. - 6
سویا منبع خوبی از نیتروژن برای تولید آنزیم های پروتئولیتیک است .نتایج نشان دادند سوبسترای دارای مقادیر بالاتر سویا - %60 - حداکثر شرایط بهینه را برای تولید پروتئاز در تخمیر کوجی دارا بوده است. در هر حال سوبسترای دارای مقادیر بالاتر جوانه گندم بیشترین فعالیت آمیلازی را نشان داد - . - 1 بالاترین میزان فعالیت آنزیم آمیلاز 731.53 واحد بر گرم وزن خشک بوده است که در نمونه دارای %40 سویا مشاهده شد. در واقع منبع غنی کربوهیدرات کپک را برای تولید آمیلاز ترغیب میکند. تجزیه کربوهیدرات نیازمند متابولیسم کپک آسپرژیلوس اوریزا میباشد بنابراین تولید آنزیم به طور مستقیمی با رشد کپک همراه است . - 6 - تاثیر ترکیبات مختلف سوبسترا روی محتوای قندهای احیا
