بخشی از مقاله
آهارگیري پارچه پنبهاي با استفاده از آلفا-آمیلاز جدا شده از یک سویه بومی
چکیده:
در این مطالعه بهینهسازي آهارگیري آنزیمی پارچه پنبهاي با آلفا- آمیلاز حاصل از سویه بومی Bacillus sp. KR-8104 که مستقل از کلسیم و آلودگیهاي یونی فلزي است و همچنین داراي فعالیت بالایی در شرایط اسیدي میباشد انجام شد. حداکثر تولید آنزیم در دماي 45˚C، pH=5- 6 و گذشت 30 -35 ساعت پس از کشت در محیط تولید کسب شد. آهارگیري بهینه بر مبناي درصد کاهش وزن و درجه تگوا در دماي 60˚C، pH=6، زمان 30 دقیقه و مقدار آنزیم معادل با 4/5 IU بدست آمد. آهارگیري آنزیمی و اسیدي به صورت همزمان میسر شد. علاوه بر آن آهارگیري آنزیمی و demineralization میتوانند در pH هاي پایین و یک مرحله انجام شوند. نتایج نشان دادند که آهارگیري آنزیمی میتواند در محدوده وسیعی از دما بین 30-70 درجه سانتیگراد به طور مطلوبی انجام شود. به کارگیري نمکهاي کلرید باریم در هر دو غلظت 5 و 10 میلی مولار و همچنین کلرید پتاسیم در غلظت 10 میلی مولار سبب افزایش فعالیت آنزیم و راندمان آهارگیري میگردد. به علت اینکه راندمان آهارگیري تحت تاثیر EDTA و اکثر آلودگیهاي یونی فلزي نامطلوب مانند سختیها قرار نمیگیرد میتوان از شلاتورها به منظور حذف یونهاي مزاحم در حمام آهارگیري بهره جست. نتایج فوق سبب بهبود در آهارگیري آنزیمی و فرایندهاي بعدي پارچه پنبهاي میگردد که میتواند موجب ذخیرهسازي موثر در انرژي، زمان و هزینههاي صنعت نساجی شود.
واژههاي کلیدي: آهارگیري آنزیمی-آلفا- آمیلاز مستقل از کلسیم-pH هاي اسیدي-Demineralization اسیدي-شلاتورها
-1مقدمه
جهت افزایش استحکام، بهبود مقاومت سایشی و خواباندن پرزهاي سطحی به نخهاي تار در قسمت مقدمات بافندگی آهار اضافه میگردد. نشاسته و مشتقات آن از متداولترین مواد آهارزنی به شمار میآیند. به دلیل ایجاد مشکلات در عملیات بعدي مانند تکمیل و رنگرزي، آهارگیري مرحله اولیه ضروري در آمادهسازي پارچه پنبهاي است. به علت مشکلات زیادي که در روشهاي متعدد قدیمی براي جداسازي آهار وجود دارد، استفاده از بیوکاتالیستها بسیار مورد توجه است .[1] آلفا-آمیلازها آنزیمهاي صنعتی مهمی هستند و اهمیت فراوانی در بیوتکنولوژي دارند. هر چند منابع مختلفی قادر به تولید آلفا-آمیلاز میباشند، آنزیمهاي جداشده از منابع میکروبی به ویژه جنس باسیلوس به دلیل مزایاي متعدد به گستردگی در صنعت مورد استفادهاند 2] و .[3
-2 روش تحقیق
-1-2 دستگاهها و مواد شیمیایی مورد استفاده. اسپکتروفتومتر (Pharmacia Biotech) UV-Vis، سانتریفیوژ یخچالدار (Hettich)، بنماري (Memmert)، انکوباتور شیکردار (Labcone)، هود لامینار و اتوکلاو. دترجنت و نفوذ دهنده از شرکت رودولف (Rudolf group, Germany) و سایر مواد شیمیایی مورد نیاز از شرکت مرك (Darmstadt, Germany) خریداري شد.
-2-2 میکروارگانیسم و سوبسترا. از بین سویههاي جداشده در دانشگاه گیلان و دانشگاه تربیت مدرس از مناطق مختلـف کشـور، سویه Bacillus sp. KR-8104 انتخاب شد .[2] پارچه 100% پنبهاي با بافت ساده 1/1، تراکم تاري و پودي 22 cm-1، نمره نخ تار و پود 20 انگلیسی و وزن در متر مربع پارچه 88 gr/m2 به عنوان سوبسترا از کارخانه ایران پوپلین تهیه شده است.
-3-2 تولید و تغلیظ آنزیم. یک لوپ از سویه رشد کرده روي محیط نگهداري به محیط مایع پیشکشت تلقیح میشد. سپس براي 18-20 ساعت در دماي 37˚C انکوبه شد. پس از تکثیر باکتري، از این محیط میزان 5% حجم محیط تولید در شرایط اسـتریل بـه محیط تولید تلقیح شد. تولید آنزیم در زمانهاي متعدد پس از کشت در دما و pH هاي مختلف محیط تولیـد بـا سـنجش فعالیـت آنزیمی بررسی شد.محیطهاي کشت باکتریایی عبارت بودند از:
محیط نگهداري Meat extract 3; peptone 5 ; yeast extract 15 ; and agar-agar 18-20 :(gr)
محیط پیشکشت Nutrient broth 8; meat extract 10; soyameal peptone 10; potato starch 10; and NaCl 0.5 :(gr) محیط تولید Potato starch 10; soyameal peptone 4; meat extract 3 ; CaCl2 .H2O 0.5; MgSO 4.7H2O 0.3; K 2HPO4 1 :(gr)
با آب مقطر به حجم نهایی 1000 میلیلیتر رسانده شد و pH محیط نگهداري و پیش کشت 6/8 تنظیم شد.پس از تولید بهینه آنزیم، محیط کشت تولید سانتریفیوژ و با سولفات آمونیوم اشباعسازي شد. رسوب حاصل در حداقل حجم بافر 20 میلیمولار تریس pH=7/4 حل و بهعنوان منبع آنزیمی استفاده گردید.
-4-2 تعیین فعالیت آلفا-آمیلاز. به این منظور روش Bernfeld استفاده شد .[4] محلولها شامل بافر تریس20 میلیمولار pH=7/4، هیدروکسید سدیم 2 نرمال، محلول رنگی DNS ، نشاسته % 1 و محلول آنزیمی بود. برحسب تعریف یک واحد (IU) آلفا-آمیلاز مقدار آنزیمی است که 1 μmol قند احیایی را در یک دقیقه آزاد میکند وقتی که مالتوز بهعنوان استاندارد استفاده شود. فعالیت نسبی آنزیم در pH=7/4 اما دماي محیط سنجش متغیر و همچنین در pH هاي 3 تا 10 (بافر50 mM فسفات- گلیسین-استات) و دماي ثابت اتاق تعیین شد. غلظتهاي 5 و 10 میلیمولار از نمکهاي کلرید مختلف و EDTA در بافر 20 میلی مولار تریس تهیه و فعالیت نسبی آنزیم در دماي محیط و طبق روش معمول اندازهگیري شد.
-5-2 آهارگیري و بررسی درجه آهارگیري. شستشوي اولیه در حضور دترجنت و نفود دهنده، آهارگیري در شرایط بهینه شده انجام و شستشوي نهایی در حضور دترجنت و کربنات سدیم به مدت 10 دقیقه تا نقطه جوش ادامه یافت. تمام عملیات در L.R. 1:50 انجام گرفته و حذف آهار با تعیین دقیق درجه آهارگیري توسط درجه تگوا و درصد کاهش وزن پارچه بیان شده است.
-3 نتایج و بحث
-1-3 انتخاب سویه. از بین سویههاي باکتریایی جداشده مولد آلفا- آمیلاز از منابع طبیعی کشور مانند: خاك مزارع سیبزمینی همدان و کرج، دریاچه ارومیه، خاك شورآباد، خاك ورامین، خاك مزرعه چاي فومن، چشمه آب گرم مشکینشهر و پساب زیتون سرانجام یک سویه باسیلوسی مزوفیل، Bacillus sp. KR-8104 که از خاك مزارع سیبزمینی کرج جدا شده بود برگزیده شد. با اضافه کردن محلول لوگل در اطراف ایزولههایی که قادر به تجزیه نشاسته محیط کشت بودند هالهاي شفاف تشکیل میشد. تشکیل این هاله در اطراف کلونی نشان میدهد که سویه مورد نظر حاوي آمیلاز است (شکل .(1a
-2-3 تولید آنزیم و بهینهسازي محیط تولید
-1 -2-3 تولید اولیه آنزیم. تولید آمیلاز از زمان حدود 10 ساعت بهطور ناگهانی افزایش مییابد و بین زمانهاي30 تا 35 ساعت به حداکثر میرسد. فعالیت آمیلازي محیط کشت که از این زمان به بعد مورد بررسی قرار گرفته است، کاهش یافت (شکل.(1b
-2 -2-3 بهدست آوردن دما و pH بهینه تولید. بررسی اثر دما بر تولید آنزیم (شکل (1c نشان داد که این سویه قابلیت تولید آنزیم را در دماي 45˚C در مدت زمان کوتاهتر و تولید آنزیم بالاتري نسبت به دماهاي 35، 40 و 50˚C دارا است. حداکثر تولید مربوط به محیطهاي کشت با pH هاي 5 و 6 بود و در pH هاي بین 6 تا 9 میزان تولید آنزیم قابل توجه بود (شکل .(1d
