بخشی از مقاله
مقدمه
لیپازها - EC 3.1 .1.3 - گروهی از آنزیمها هستند که به صورت طبیعی میتوانند هیدرولیز تريگلیسریدهاي بلندزنجیره را کاتالیز نمایند. با این حال، در شرایط مناسب عملیاتی، لیپازها میتوانند به عنوان کاتالیست در واکنشهاي استریفیکاسیون داخلی، الکولیز، اسیدولیز و استریفیکاسیون حضور فعال از خود نشان دهند .[1] قارچها و باکتريها مهمترین منابع تامین لیپاز میکروبی میباشند. آنزیمها را به دو دسته برون سلولی و درون سلولی طبقه بندي میکنند. در صورتیکه آنزیم برون سلولی باشد، براي دستیابی به آنزیم نیاز به عملیات پیچیده و پرهزینه جداسازي و خالصسازي خواهد بود. زمانی که بتوان از خود سلول به عنوان بیوکاتالیست - آنزیم درونسلولی - استفاده کرد نیاز به استخراج و تخلیص آنزیم نمیباشد. به همین علت استفاده مستقیم از سلولهاي قارچی تولیدکننده لیپاز که بر پایه نگاهدارنده مناسب تثبیت شدهاند به دلیل حل مشکلات پایداري آنزیم و مسایل اقتصادي بسیار مورد توجه قرار گرفته است. مطالعات محققان نشان داده است که قارچ رایزوپوس اوریزا در تولید لیپاز از فعالیت بالایی برخوردار است .[2] نگاهدارنده طبیعی سنگ آذرین که از سرد شدن مواد مذاب حاصل از آتشفشان حاصل شده، بدلیل تخلخل بالا و بیتاثیر بودن در واکنشها به عنوان نگاهدارنده جهت تثبیت سلول قارچی مناسب میباشد .[3] در این تحقیق، سلولهاي قارچی رایزوپوس اوریزا با هدف تولید بیوکاتالیست سلولی بر نگاهدارنده طبیعی سنگ آذرین تثبیت شد. تاثیر زمان کشت و همچنین مشخصههاي نگاهدارنده بر میزان رشد سلولی و فعالیت آنزیم لیپاز بررسی گردید.
مواد و روشها میکروارگانیسم و محیط کشت
میکروارگانیسم رایزوپوس اوریزا PTCC 5174 از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهشهاي علمی و صنعتی ایران خریداري گردید. محیط مورد نظر براي رشد میکروارگانیسم بر روي اسلنت 4 درصد پتیتودکستروزآگار و 2 درصد آگار تهیه شد. محیط کشت پایه شامل: 70 g پلی پپتون، 1 g سدیم نیترات، 1 g پتاسیم دي هیدروژن فسفات و 0/5 g منیزیم سولفات 7 آبه در 1 لیتر آب مقطر بوده است. pH محیط کشت با استفاده از سولفوریک اسید 0/5 نرمال در 5/6 تنظیم شد. منبع کربن مورد نظر شامل روغن زیتون به میزان 30 g/l به محیط کشت پایه اضافه شد. روغن زیتون از بازار داخلی تهیه شد. پلیپپتون از شرکت لیوفیلکم ایتالیا خریداري گردید. اولئیک اسید، متانول و دیگر مواد مورد نیاز از شرکتهاي تجاري معتبر با خلوص آزمایشگاهی تهیه شد. آمادهسازي نگاهدارنده سلولی قطعات سنگ آذرین به اندازههاي مکعبی مورد نظر برش داده شد. تکههاي سنگ آذرین ابتدا با محلول سدیم هیدروکسید 0/1 نرمال و سپس محلول اسید سولفوریک 0/1 نرمال به مدت زمان 10 دقیقه شستشو داده شدند. این قطعات در آب جوشانده شده و سپس تا خنثی شدن با آب مقطر شسته شدند. قطعات سنگ آذرین بعد از خشک کردن به عنوان نگاهدارنده سلولی مورد استفاده قرار گرفتند .[3]
کشت سلولی و تثبیت آن بر نگاهدارنده
ارلن شامل 50 ml از محیط کشت به همراه تعداد مورد نظر از نگاهدارنده سلولی با اندازه معین در دماي 121 ºC و فشار 15psi استریل شد. اسپورهاي قارچی به میزان یک لوپ کامل درشرایط استریل از اسلنت رشدیافته به محیط کشت تلقیح شد. گرمخانهگذاري ارلنهاي تلقیحشده در دماي 30 ºC و دور شیکر 150 rpm با مدت زمان مورد نظر به انجام رسید. پس از جداسازي سلولهاي تثبیتیافته بر سنگ آذرین از محیط کشت به وسیله عمل فیلتراسیون، عملیات شستشو با آب به مدت 1 دقیقه و استون به مدت 5 دقیقه به انجام رسید. سلولهاي تثبیتیافته در آون تحت خلا و به مدت 3 روز خشک شدند. مقدار توده سلولی تثبیت شده بر پایه سنگ آذرین از تفاوت میان جرم نگاهدارنده قبل و بعد از تثبیت تعیین شد.
واکنشهاي آنزیمی و سنجش فعالیت لیپاز میزان فعالیت لیپاز از طریق واکنشهاي هیدرولیز و متانولیز تعیین شد. فعالیت آنزیم لیپاز برون سلولی بوسیله واکنش هیدرولیز روغن زیتون در حضور 1 ml از محیط کشت انجام شد. این واکنش شامل 2 g روغن زیتون، 9 ml بافراستات 0/1 مولار با 5/6 pH و 1 ml کلسیم کلرید 0/05 مولار در بطري با درب پیچی به حجم 50 ml در شیکرانکوباتور با دور 250 rpm و دماي 30 ºC در زمان 10 دقیقه به انجام رسید. واکنش هیدرولیز درون سلولی بوسیله 10 عدد از ذرات نگاهدارنده سلولی در شرایط مشابه واکنش هیدرولیز برونسلولی انجام شد. واکنش با اضافه کردن 20 ml اتانول متوقف و مقدار اسید چرب موجود در محیط به وسیله تیتراسیون با سدیم هیدروکسید 0/1 مولار تعیین شد. تولید 1 μmol از اسید چرب در هر دقیقه به عنوان واحد فعالیت هیدرولیز لیپاز گزارش شد. واکنش استریفیکاسیون اولئیک اسید با متانول - متانولیز - با استفاده از 10 عدد از کاتالیستهاي سلولی تثبیتشده به انجام رسید. محیط واکنش شامل 1/93 g اولئیک اسید، 0/3 ml بافر پتاسیم فسفات 0/1 مولار با 6/8 pH و 0/1 ml متانول در بطري با درب پیچی به حجم 50 ml در شیکرانکوباتور با دور 150 rpm و دماي 30ºC در زمان 2/5 ساعت به انجام رسید. واکنش با اضافه کردن 20 ml اتانول متوقف و مقدار اولئیک اسید باقیمانده بوسیله تیتراسیون با سدیم هیدروکسید 0/1 مولار تعیین شد. میزان 1 μmol از متیل اولئات تولید شده در دقیقه به عنوان واحد فعالیت متانولیز درون سلولی گزارش شد.
نتایج و بحث بررسی اثر تعداد و اندازه نگاهدارنده سلولی بر تولید لیپاز
اثر اندازه و تعداد نگاهدارندههاي سلولی بر روي نحوه تثبیت گونه قارچی رایزوپوس اوریزا و تاثیر آن بر فعالیت آنزیمی لیپاز بررسی شد. به منظور در نظر گرفتن شرایط گستردهتر واکنش، در مورد آنزیم درونسلولی، فعالیت لیپاز در شرایط مایی - هیدرولیز - و غیرمایی - متانولیز - اندازهگیري شد. بدین جهت از تعداد 10 عدد قطعات مکعبی سنگهاي آذرین با اندازههاي متفاوت 8 و 10 mm به عنوان پایه تثبیت در محیط کشت استفاده شده و زمان 96 ساعت براي کشت میکروارگانیسم در نظر گرفته شد. نتایج بدست آمده در جدول 1 ارائه شده است. با افزایش اندازه نگاهدارنده سلولی، میزان وزن توده سلول تثبیتشده بر آن بیشتر شده ولی در فعالیت لیپاز درون سلولی که به ازاي وزن سلول تثبیتشده گزارش میشود تفاوت معناداري مشاهده نشد. با افزایش اندازه نگاهدارنده، سطح دردسترس براي تثبیت سلول افزایش مییابد و به این ترتیب وزن توده سلولی بالاتري به ازاي هر قطعه از نگاهدارنده حاصل خواهد شد. افزایش سطح در دسترس میتواند با افزایش تعداد نگاهدارندهها در محیط کشت نیز به انجام رسد که در این آزمون مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین فعالیتهاي آنزیم لیپاز درون سلولی با استفاده از 30 قطعه مکعبی شکل از
