بخشی از مقاله
چکیده:
جدایه قارچ T. viride از خاک ایزوله گردید و سوسپانسیون اسپور آن در دز 250 گری پرتو گاما برای القای موتاسیون پرتوتابی شد. موتانت های قارچ T. viride و جداسازی جدایه های موتانت آن، برای تولید آنزیم های کیتینولیتیک خارج سلولی با استفاده از روش تخمیر غوطه وری مورد استفاده قرار گرفت. کیتین کلوئیدی به عنوان سوبسترای تولید آنزیم و سنجش فعالیت آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. جهت سنجش پروتئین خارج سلولی از روش بردفورد استفاده گردید. همچنین خلوص و ترکیب نمونه های پروتئینی غنی از آنزیم کیتیناز با استفاده از آزمون SDS-PAGE مورد مطالعه قرار گرفت.
بالاترین میزان غلظت پروتئین خارج سلولی به ترتیب در نمونه های موتانت T. v M7 و T. v M8 مشاهده شد. جدایه های موتانت T. v M19، T. v M1، T. v M5، T. v M4 و T. v M6 بالاترین میزان فعالیت آنزیم کیتیناز را به خود اختصاص دادند. نتایج آزمون SDS-PAGE دلالت بر حضور آنزیم های -1,4-N acethyl glucoseaminidase و acetyl glucosaminase در جدایه های مختلف داشت. بالاترین فعالیت آنزیمی به ترتیب در جدایه T. v M19 مشاهده شد که دارای بالاترین مقادیر آنزیم های اندوکیتینازی - 42 و - 31 KDa و آنزیم KDa - - - 1,4 - -N-acetyl glucoaminidase - 73 بود. نتایج این مطالعه به روشنی نشان می دهد که القای موتاسیون با پرتوگاما در قارچ تریکودرما منجر به بهبود تولید آنزیم های کیتیناز برای کنترل بیولوژیک بیماری های گیاهی در آن می شود.
واژگان کلیدی: فعالیت آنزیمی، Trichoderma viride، کیتیناز، .SDS-PAGE
مقدمه
کنترل بیمارگر های خاکزاد گیاهی بسیار مشکل بوده به نحوی که روش های زراعی و کاربرد مواد شیمیایی در برخی از موارد نتوانسته است، سبب ممانعت از خسارت قارچ های پاتوژن بیماریزای گیاهی شود. اگرچه باکتری های آنتاگونیست از اهمیت زیادی در مبارزه بیولوژیک برخوردارند، اما تعدادی از قارچ ها نیز به عنوان عوامل مبارزه بیولوژیک شناخته شده اند - Weller . - et al., 2002 مکانیسم عمومی در کنترل بیولوژیکی به دو نوع تاثیر مستقیم و غیر مستقیم - عامل بیوکنترل بر بیمارگر گیاهی - تقسیم می شود. اثرات مستقیم شامل رقابت برای غذا و مکان تولید آنتی بیوتیک ها و آنزیم ها و غیر فغال کردن آنزیم های بیمارگر می باشد. اثرات غیر مستقیم نیز شامل تمامی فعالیت هایی که می تواند سبب تغییرات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاه میزبان - نظیر تنش های مختلف، حلالیت ترکیبات غیر آلی و هم چنین القای مقاومت سیستمیک - شود - , Viterbo et al. . - 2002 جنس Trichoderma spp
از جمله قارچ های آزادزی هستند که عمدتاً در خاک فعالیت نموده و به عنوان عوامل کنترل بیولوژیک مؤثر علیه دامنه بسیار وسیعی از ارگانیسم های بیمارگر شامل قارچ های بیمارگر گیاهی - اعم از خاکزاد و هوا زاد - باکتری ها، پروتوزوآها، نماتدها و حتی ویروسها شناخته میشوند . - Howell, 2003 - گونه های تریکودرما به چند شیوه علیه موجودات هدف عمل می کنند. سویه های پارازیت کننده قارچ میزبان، اثر خود را از طریق نفوذ مستقیم در هیف میزبان ویا تولید آنزیم های خارج سلولی اعمال می کنند. علاوه بر آن، ممکن است آنتی بیوتیک های ضد قارچی تولید نموده و نیز آنزیم های هیدرولیز کننده القاکننده بیماری زایی را در پاتوژن مهار نمایند. همچنین ممکن است تجزیه کننده های مواد آلی بوده و به ویژه وقتی که عناصر غذایی، عامل محدود کننده به شمار می آیند، به عنوان رقیب پاتوژن های قارچی در فازهای ساپروبیک عمل کنند.
گزارش شده است که برخی از سویه ها، فعالیت باکتری های ساپروبیک و قارچ های مایکوریزا1 را افزایش می دهند و بعضی هم به عنوان محرک های رشد گیاهی مطرح بوده و سبب افزایش در اندازه گیاه، سطح و وزن برگونیز القای مقاومت در گیاه نسبت به پاتوژن های گیاهی می گردند. نقش دوگانه فعالیت آنتاگونیستی علیه بیمارگرهای گیاهیو بهبود حاصلخیزی خاک، باعث می شود سویه های تریکودرما جانشین خوبی برای قارچ کش ها و مواد ضدعفونی کننده تدخینی باشند. بسیاری از سویه های تریکودرما که دارای پتانسیل کنترل بیماری ها هستند، معرفی شده اند . - Monte, 2001 - با مشخص شدن عوامل ژنتیکی دخیل در القای مقاومت، امکان ایجاد موتان های جدید با قابلیت های برتر برای اجرای کنترل بیولوژیکی مورد بررسی قرار گرفته است.
دانشمندان با ایجاد تغییرات ژنتیکی در آنتاگونیست ها سعی می کنند تا کیفیت عمل آنها را به عنوان عوامل کنترل بیولوژیکی ارتقا دهند. یکی از روشهای بکار گرفته شده برای افزایش توانایی آنتاگونیست، القای موتاسیون تصادفی با بکارگیری موتاژن های فیزیکی نظیر امواج الکترومغناطیس UV، X، گاما و یا استفاده از موتاژن های شیمیایی مانند اتیل متان سولفانات می باشد . - Gohel et al., 2004 - در این پژوهش قارچ Trichoderma viride از خاک جداسازی گردیده و با استفاده از پرتوتابی گاما القای موتاسیون در آن صورت گرفته است و جدایه های موتانت آن از نظر میزان تولید پروتئین خارج سلولی و الگوی الکتروفورتیک آن و تغییرات فعالیت آنزیم کیتیناز مورد مطالعه قرار گرفته است.
مواد و روش ها
تولید کیتین کلوئیدی کیتین کلوئیدی به عنوان منبع کربن برای تولید آنزیم های کیتیناز و سنجش فعالیت آنزیم کیتیناز مورد استفاده قرار میگیرد، چراکه القا کننده آنزیم کیتیناز می باشد. کیتین کلوئیدی بوسیله پیش تیمار کیتین پوست میگو در اسید ارتوفسفریک 85 - w/v - % برای مدت 24 ساعت در 4 & انجام گرفت تا خاصیت کلوئیدی در کیتین افزایش پیدا کند به نحوی که به آسانی توسط آنزیم مورد استفاده قرار گیرد. بعد از پیش تیمار با اسید، مواد جامد با استفاده از یک فیلتر پارچه ای صاف شد و چندین مرتبه با آب مقطر شستشو گردید تا pH ماده جامد به حدود 5 برسد. سپس کیتین کلوئیدی در دمای -70 & برای مدت 24 ساعت منجمد گردید و با استفاده از خشک کن انجمادی برای مدت 48 ساعت خشک گردید و تا اندازه مش 53-125 میکرون آسیاب شد.
تولید آنزیم کیتیناز
جدایه های قارچ T. viride - موتانت و وحشی- کلکسیون گروه پژوهشی گیاه پزشکی و نگهداری مواد غذایی پژوهشکده کشاورزی هسته ای - بر روی محیط کشت MYG agar حاوی 5 g.L-1 عصاره مالت، 2/5 g.L-1 عصاره مخمر، 10 g. L-1 گلوکز و 20 g. L-1 آگار کشت داده شدند و در دمای 28 & گرمخانه گذاری گردیدند. با استفاده از محلول سیلین از پلیت های هفت روزه حاوی اسپور، سوسپانسیون اسپوری با جمعیت 107-108 spore.ml-1 تهیه گردید. کشت اولیه سوسپانسیون اسپوری در محیط - TCM - Trichoderma complete medium حاوی 1گرم در لیتر باکتوپپتون، 0/3 گرم در لیتر اوره، 2 گرم در لیتر KH2PO4، 1/4 گرم در لیتر - NH4 - 2SO4، 0/3 گرم در لیتر MgSO4.7H2O، 0/3 گرم در لیتر CaCl2.6H2O، 0/005 گرم در لیتر FeSO4.7H2O، 0/002 گرم در لیتر MnSO4، 0/002 گرم در لیتر ZnSO4 و 0/002 گرم در لیتر CoSO4.7H2O و 2 میلی لیتر در لیتر توئین انجام گرفت. pH محیط کشت TCM بر روی 5/5 تنظیم گردید و به آن - w/v - % 0/3 گلوکز افزوده شد. انجام عمل تخمیر در محیط کشت TCM در ارلن مایر 250 ml حاوی 50 ml محیط TCM در دمای 28 & به مدت 24 ساعت و 180 rpm انجام گرفت و بعد از مدت زمان فوق اسپورها تبدیل به حالت رویشی میسلیوم گردیدند. با استفاده از سانتریفوژ کردن در 4500 rpm به مدت 7 دقیقه میسلیوم ها از محیط TCM جداسازی شدند و جهت القای تولید آنزیم های
