بخشی از مقاله
بیان مسئله: در زهر زنبور عسل آنزیم های مختلفی مانند فسفولیپازA2، هیالورونیداز، .اسید فسفاتاز، ... - وجود دارد که آنزیم فسفولیپاز یکی از فراوان ترین آن ها است. لذا افزایش اطالعات در رابطه با این آنزیم می تواند برای صنعت داروسازی مفید باشد. از آن جایی که این آنزیم یکی از کشنده ترین اجزای سم حشرات و خزندگان می باشد و همچنین در زهر زنبورعسل بعنوان آلرژن مطرح است لذا تولید آن توسط ایجاد رده های سلولی پایدار جهت مطالعات فارماکولوژیک ضروری می باشد.
در صورت نیاز به بیان مداوم ژن، تولید سل الین های پایدار مورد نیاز است. تهیه الین های سلولی پایدار جهت تهیه پروتئینهای نوترکیب دارویی، تحقیقاتی و تشخیصی و آنتی بادی های مونوکلونال در سطوح باال بخش مهمی از تحقیقات داروسازی را به خود اختصاص می دهد. که بطور قابل مالحظه ای سبب صرفه جویی در وقت و هزینه می گردد و سبب بیان ژن موردنظر بطور مداوم و کنترل شده می گردد.
هدف پژوهش: تولید رده سلولی پایدار جهت بیان فسفولیپازA2 زهر زنبور عسل - آپیس ملیفرا -
روش کار: این پروسه شامل سنتز ژن و طراحی وکتور، ترانسفکشن و جای گیری توالی ژن مورد نظر داخل ژنوم و انتخاب این سلول ها بر اساس مقاومت انتی بیوتیکی، غربالگری ازدیاد و تکثیر کلون های انتخاب شده و تخلیص پروتئین ها می باشد. پس از سنتز ژن فسفولیپاز A2 و قرار دادن آن در وکتور PCDNA توسط کمپانی ماکروژن اقدام به ازدیاد پالسمید در باکتری اشرشیاکالی گردید. سپس ترانسفکت نمودن سلولهای CHO، با پالسمید حاوی ژن با روش کلرور کلسیم و بیان ژن در محیط کشت هامز اف 12 حاوی آنتی بیوتیک نئومایسین. در سه مرحله تعیین غلظت مناسب آنتی بیوتیک، ترانسفکشن و انتخاب و ازدیاد کلون های حاوی پالسمید انجام پذیرفت.
بطور معمول اغلب سلول هایی که پالسمید وارد ان ها نشده است می میرند ولی سلول های حاوی پالسمید بعد از 9 روز زنده می مانند. پس از این که پلیت کامال از سلول پر شد سلول ها میتوانند بعنوان رده پلی کلونال در نظر گرفته شوند. سپس این رده های پلی کلونال توسط تکنیک رقت محدود - limiting dilution - در پلیت های 96 خانه ای کشت داده می شوند تا بتوان کلون های مونوکلونال را انتخاب نمود و بسط داد. در نهایت اقدام به جمع آوری و تغلیظ سوپ سلول های انتخاب شده و انجام SDS-PAGE جهت بررسی و بیان پروتئین مذکورگردید.
یافته ها و نتیجه گیری: در آزمایش الکتروفورز که بمنظور تایید بیان ژن فسفولیپاز A2 در سوپ سلولها انجام پذیرفت باندی قابل انتظار با وزن مولکولی حدود 20 کیلودالتون بدست آمد که با گزارشات دیگر محققین در این خصوص مطابقت داشته است. از آن جایی که فسفولیپاز A2 از ترکیبات مهم توکسیک و آلرژیک زهر زنبورعسل می باشد لذا مطالعات تشخیصی و درمانی در رابطه با این آنزیم نیاز به پروتئین کافی و خالص دارد. تولید نوترکیب این پروتئین نیازمند فراهم سازی رده های سلولی پایدار می باشد تا بتوان بصورت کنترل شده و مداوم و با صرف کمترین وقت و هزینه اقدام به تولید مقادیر مناسب پروتئین نمود. integration جاگیری توالی دی ان ای خارجی به داخل ژنوم سلول یوکاریوتِ می تواند از طریق بکارگیری سیستم های تغییر و ترمیم دی ان ای اندوژن انجام پذیرد.
