بخشی از مقاله
چکیده
قطعات حاصل از انتهاي آمین آنتی بادي هاي حاصل از شتر که قادر به تولید آنتی بادي هایی فاقد زنجیره سبک می باشند VHH یا نانوبادي نام داشته و داراي توانایی کامل اتصال به آنتی ژن می باشند. برخی از مزایاي نانوبادي ها قابلیت تولید آسان و انبوه آنها در میکروارگانیسم ها و توانایی استفاده از آنها در سیستم هایی از قبیل نمایش فاژي، مخمري یا ریبوزومی می باشد. نانوبادي ها داراي قابلیت نفوذ بالایی به درون بافت ها هستند و این ویژگی آنها ابزاري مناسب جهت مهار میکروارگانیزم می کند. سالمونلا از بیماري زا ترین گونه باکتري ها می باشد و با نفوذ به درون بافت خود را از سیستم ایمنی میزبان پنهان می کند.
لیپوپلی ساکارید باکتري سالمونلا نقش عمده اي در بیماري زایی آن ایفا می کند و آنتی ژن O این باکتري یکی از عوامل اصلی توانایی این باکتري در مقابله با سیستم ایمنی می باشد. هدف این پژوهش تهیه نانوبادي هایی با قابلیت اتصال به لیپوپلی ساکارید باکتري سالمونلا تیفی موریوم با استفاده از سیستم نمایش فاژي می باشد. به این منظور پس از جداسازي لنفوسیت ها از خون شتر غیر ایمن، RNA تخلیص و با استفاده از پرایمر هاي Oligo dT به cDNA تبدیل شدند. قطعات کد کننده VHH توسط Nested PCR بوسیله پرایمر هاي اختصاصی تکثیر شده و پس از هضم توسط آنزیم اندونوکلئاز SfiI به فاژمید pComb3X الحاق شدند. فاژمید هاي نوترکیب با استفاده از الکتروپوریشن به باکتري E.coli XL1 Blue منتقل گردیده و آزادسازي آنها توسط فاژ هاي کمکی m13k07 انجام شد.
کلمات کلیدي: نانوبادي، لیپوپلی ساکارید، سالمونلا تیفی موریوم ، نمایش فاژي،
مقدمه
جنس سالمونلا را گروهی از باکتريهاي متنوع از لحاظ بیوشیمیایی و سرولوژیک تشکیل میدهند. این باکتريها علاوه بر انسان تعداد زیادي از حیوانات را آلوده کرده و میتوانند به بافتهاي خارج رودهاي نیز حمله و تب رودهاي ایجاد نمایند که حاد ترین شکل آن تب تیفوئید است. قدرت نفوذ سالمونلا به درون بافت ها و اتصال آن به گیرندههاي سلولهاي میزبان و زندگی داخل سلولی از مهمترین عوامل حدت آن می باشند و ممکن است بوسیله آنتیژنهاي سطحی O صورت گیرد. از این منظر کلنی هاي Smooth سالمونلا مانند شیگلا ها بیماریزا بوده و انواع داراي کلنی Rough که داراي نقصی در زنجیرههاي جانبی اختصاصی O در لیپوپلی ساکارید میباشند غیر بیماریزا هستند. آنتیژن O سالمونلا در تعیین میزان حساسیت بعضی از سروتیپها به سیستم کمپلمان، پروتئینهاي کاتیونیک بدن میزبان و همچنین ماکروفاژ هاي میزبان نیز اهمیت دارد.
ارگانیسمهاي داراي آنتیژنهاي O سالم در مقابل اثر کشندگی کمپلمان سرم نرمال مقاومتر از سویههاي خشن Rough هستند. [1] مقاومت در برابر سیستم ایمنی سرم نرمال احتمالا به خاطر پوشیدن Lipid A و پلیساکارید Core که فعال کننده کمپلمان هستند توسط پلیساکارید آنتیژن O می باشد .[2] میزان اتصال و مهار ارگانیسم بوسیله ماکروفاژها نیز در عدم وجود کمپلمان در سطح باکتري تحت تاثیر قرار میگیرد. آنتیژن هاي O مختلف به درجات متفاوتی در دور کردن اجزاء کمپلمان و جلوگیري از فعالیت کمپلمان در سطح ارگانیسم نقش دارند، که خود باعث تفاوت در فاگوسیتوز سروتایپهاي مختلف میشود. قابلیت آنتیژن O در محافظت یک ارگانیسمدر مقابل اثر کمپلمان و فاگوسیتوز احتمالاً عملکرد سروتایپ است[3] با توجه به مطالب یاد شده تهیه آنتی بادي با قابلیت اتصال به لیپوپلی ساکارید این باکتري مانع عملکرد آنتی ژن O شده و لذا می تواند از بیماري زایی این باکتري جلوگیري به عمل آورد.
تمامی خانواده شتر ها داراي آنتی بادي هاي غیر معمولی در خون خود هستند. بر خلاف دیگر آنتی بادي ها، این آنتی بادي ها فاقد زنجیره سبک بوده و تنها از دایمر زنجیره سنگین تشکیل شده اندو به آنها آنتی بادي هاي زنجیره سنگین - HCAbs - گفته می شود. [4] آنتی بادي هاي معمول از دو زنجیره یکسان سنگین و دو زنجیره یکسان سبک تشکیل شده اند که توسط یک پیوند دي سولفیدي به یکدیگر متصل می شوند. قطعه Fab این آنتی بادي ها متشکل از دومن ساختاري CH1 و مناطق اتصال به آنتی ژن زنجیره سبک و سنگین می باشد. آنتی بادي هاي زنجیره سنگین شتري داراي ساختار منحصر به فردي می باشند، این آنتی بادي ها داراي یک دومن متغییر بوده VHH - یا - Nanobody، منطقه لولا و دو دومن ثابت CH2 و CH3 هستند و داراي همولوژي بالایی با مناطق ساختاري CH2 و CH3 آنتی بادي هاي معمول می باشند. [4]
این آنتی بادي ها فاقد دومن ثابت CH1 می باشند این منطقه در ژنوم وجود داشته ولی در روند ویرایش mRNA حذف می گردد. از آنجا که این منطقه محلی جهت اتصال زنجیره سبک می باشد، عدم وجود آن می تواند دلیل نبود زنجیره سبک در این آنتی بادي ها باشد.پس آنتی بادي هاي زنجیره سنگین تنها از طریق سه ناحیه به نام CDR2 موجود بر روي انتهاي آمین زنجیره سنگین قابلیت اتصال به آنتی ژن خود را حفظ می کنند. [7-6] نانوبادي ها کوچکترین قطعات کامل داراي قابلیت اتصال به آنتی ژن می باشند. آنها تنها kDa 15 وزن داشته، 2/5nm قطر و 4nm طول دارند. نانوبادي ها داراي کاربرد هاي بسیاري در بیوتکنولوژي و صنعت پزشکی می باشند. آنها داراي توان تولید بالایی توسط میکرو ارگانیسم ها بوده و از پایداري و حلالیت بالایی برخوردار می باشند.
از نانوبادي ها می توان در تولید مولکول هاي بزرگتر و همچنین در سیستم هاي انتخابی از جمله نمایش فاژي، مخمري یا ریبوزومی استفاده نمود. [8] نمایش فاژي تکنیک قدرتمندي جهت گزینش از میان ملیون ها پروتئین یا پپتید می باشد. یکی از کاربرد هاي موفقیت آمیز از سیستم نمایش فاژي استفاده از آن در جهت جداسازي آنتی بادي هاي منوکلونال از کتابخانه هاي بزرگ آنتی بادي هايمتصل به فاژ می باشد. [10-9] با استفاده از سیستم نمایش فاژي می توان آنتی بادي هایی با تمایل بالا نسبت به آنتی ژن مورد نظر را از میان مجموعه وسیعی از آنتی بادي انتخاب و تکثیر کرد. لذا در این تحقیق بر آن شدیم که با تلفیق تکنیک هاي تهیه نانوبادي و سیستم نمایش فاژي، نانوبادي هایی بدست آوریم که با قابلیت اتصال خود با لیپوپلی ساکارید مانع عملکرد آنتی ژن O شده و بیماري زایی باکتري را مهار کنند.
مواد و روش ها
خونگیري و جداسازي لنفوسیت ها از شتر: پس از خونگیري از شتر با استفاده از ماده ضد انعقاد EDTA، لنفوسیت ها با استفاده از شیب گرادیانت فایکول جدا شده، لنفوسیت هاي تخلیص شده توسط PBS شستشو داده شد و تعداد 10 7 لنفوسیت به ویال هاي RNase Free منتقل و رسوب داده شد. لنفوسیت ها تا زمان استفاده بعدي در دماي -80 درجه نگهداري شدند.استخراج RNA از لنفوسیت هاي شتر و تهیه :cDNA جهت استخراج RNA از کیت High Pure RNA Isolation Kitشرکت Roch استفاده گردید. RNA پس از استخراج، بر روي ژل آگاروز %1 مورد بررسی قرار گرفت. RNA تخلیص شده بلافاصله توسط کیت تهیه cDNA شرکت Fermentas به cDNA تبدیل گردید.
انجام PCR اول و دوم بر روي cDNA تهیه شده: cDNA توسط پرایمر هاي اختصاصی اول و بوسیله واکنش زنجیره پلی مراز تکثیر شدند. قطعات کد کننده VHH حاصل از محصول PCR اول از ژل تخلیص و به عنوان الگو در PCR دوم استفاده شد. پرایمر هاي PCR دوم داراي توالی شناسایی آنزیم اندونوکلئاز SfiI بود.همسانه سازي محصول PCR در فاژمید :pComb3X محصول PCR دوم، و وکتور pComb3X به صورت جداگانه توسط آنزیم SfiI مورد هضم قرار گرفت.. الحاق قطعات حاصل از هضم آنزیمی و فاژمید هضم شده توسط آنزیم T4 DNA Ligase - Fermentas - در دماي 14 درجه و به مدت 20 ساعت صورت گرفت.
تکثیر فاژ هاي کمکی 1 lµ :M13K07 فاژ - Amersham - M13k07 با غلظت 1×1012 pfu به باکتري'OD600 - F برابر - 0/7 اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه در سکون و دماي 37 درجه قرار داده شد. سپس آنتی بیوتیک کانامایسین را با غلظت نهایی 70µgr/ml به محیط اضافه کرده و به مدت 48 ساعت در دماي 37 درجه و سرعت 250 دور دقیقه گرمخانه گذاري شد. فاژ هاي کمکی، از طریق رسوب باکتري ها با سرعت 5000 دور در دقیقه و تخلیص شدند. جهت حذف باکتري هاي باقیمانده، مایع رویی به مدت 30 دقیقه در دماي 60 حرارت داده شد و سپس با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید و مایع رویی بدست آمده حاوي فاژ هاي کمکی در دماي 4 درجه نگهداري شد.
تهیه سلول هاي مستعد و انتقال الکتریکی فاژمید هاي نوترکیب: جهت انتقال الکتریکی از باکتري مستعد E.coli F´ XL1 Blue تهیه شده به روش Electrocompetent استفاده شد. انتقال فاژمید هاي نوترکیب به سلول هاي مستعد توسط دستگاه الکتروپوریشن BioRad و با استفاده از برنامه هاي موجود صورت گرفت.تهیه کتابخانه فاژي نانوبادي: باکتري هاي ترانسفورم شده در محیط SB حاوي 50 µg/ml آمپی سیلین رشد داده شدند. پس از رسیدن جذب نوري در 600nm به 0/7 میزان 1012 فاژ کمکی به ازاي هر میلی لیتر محیط کشت به باکتري اضافه گردید و پس از نگهداري آنها به مدت 30 دقیقه در حالت سکون، 30 دقیقه در37 OC با سرعت 250 دور دقیقه گرمخانه گذاري شدند. سپس میزان 50 µg/ml کانامایسین به محیط اضافه کرده و در37 OC با سرعت 250 دور دقیقه به مدت 18 ساعت گرمخانه
