بخشی از مقاله
مقدمه
مسمومیت غذایی ناشی از سموم کلستریدیوم بوتولینیم یکی از کشندهترین مسمومیتهاي شناخته شده میباشد. لذا تشخیص به موقع و درمان آن میتواند از اهمیت ویژهاي بخصوص در کشورهاي جهان سوم برخوردار باشد. آنتیباديهاي زنجیره سنگین شتري یا همان نانوباديها به دلیل خواص ویژه خود مانند ثبات، حلالیتبالا، محلولبودن در آب، تحملگرمایی بالا و...کاربردهاي زیادي در بیوتکنولوژي پیدا کردهاند. با توجه به خصوصیات ویژه این آنتیبادیها میتوان از آنها براي شناسایی و درمان مسمومیتهاي ناشی از سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع E استفاده نمود.
هدف
تولید نانوبادي شتري بر علیه بخش اتصالدهنده سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع E که بطور موثري سم مورد نظر شناسایی و خنثی نماید.
روش
بخش اتصال دهنده سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع E به صورت نوترکیب تولید و به شتر تزریق شد. میزان ایمنی شترها توسط الیزا مورد آزمایش قرار گرفت. بعد از خونگیري، لنفوسیتها جداسازي و RNA تام آنها تخلیص و به cDNA تبدیل شد. تکثیر ژنهاي نانوبادي با Nested PCR انجام و ژنهاي بدستآمده در وکتور فاژمیدي مناسب قرارداده شد. و بعد از چند بار تکرار این مرحله کتابخانهژنی با غناي کافی بدست آمد. غربالگري کتابخانه علیه سم مورد نظر در پنج مرحله صورت گرفت و بعد از مرحله پنجم 20 کلنی انتخاب و به وسیله الیزا یک کلنی با تمایل زیاد به آنتیژن مورد نظر انتخاب گردید.
نتیجه
نتایج الیزا حاکی از آن است که نانوبادي تولید شده در این تحقیق تمایل زیادي به آنتیژن مورد نظر نشانداده و میتوان از آن براي تشخیص و درمان سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع E استفاده کرد.
کلمات کلیدي : نانوبادي، سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع E
تهیه نانوبادي هاي نوترکیب مشتق شده از آنتی بادي هاي زنحیره سنگین شتري بر علیه توکسین نوع E کلستریدیوم بوتولونیوم
مقدمه :
بوتولیسم نوعی بیماري عفونی همراه با فلج شل پائین رونده است که در اثر توکسین بوتولینوم - Botulinum - تولید شده بوسیله گونه هاي کلوستریدیوم و بویژه Clostridium botulinum ، ایجاد میشود. سم بوتولیسم - BONT - پروتئینی است به جرم مولکولی تقریبا 150 کیلودالتون و از سه بخش 50 کیلودالتونی تشکیل یافته است - 1و. - 2 بخش اتصال دهنده سموم بوتولیسم در انتهاي کربوکسیلی زنجیره سنگین - - HCc یکی از مهمترین ملکولهاي مورد استفاده در علم عصب شناسی و بیولوژي سلولی میباشد . تولیدآنتی بادي بر علیه این بخش از سم میتواند مانع از اتصال سم به پایانه عصب وبروز بیماري بوتولیسم شود . آنتی بادي ها از ابزار مهم تحقیقات بیولوژیکی و پزشکی بالینی به شمار می روند.
اغلب آنتی بادي ها از دو زنجیره سنگین و دو زنجیره سبک تشکیل شده اند و هر دو زنجیره سبک و سنگین در اتصال به انتی ژن نقش دارند - . - 5 خانواده شتر علاوه بر آنتی بادي هاي معمول ، آنتی بادي هاي خاصی را تولید می کنند که فقط داراي زنجیره سنگین می باشند و محل اتصال به آنتی ژن این آنتی بادي هاي غیر معمول از زنجیره سنگین تشکیل شده است که به آنها نانوبادي می گویند . از خصوصیات نانوبادي ها می توان به اندازه کوچک آنها ، حلالیت بالا ، مقاومت دمایی ، قابلیت تا شدن - Refolding - بالا و نفوذ بالاي آنها به درون بافت هاي زنده اشاره کرد - . - 3 با توجه به قابلیتهاي زیاد نانوبادیها در خنثی سازي آنتی ژنها، هدف ما در این تحقیق تولید نانوبادي علیه توکسین بوتولینیوم نوع E میباشد تا در درمان مسمومیتهاي ناشی از این سم وهمچنین شناسایی توکسین تاثیر زیادي داشته باشد.
مواد و روشها :
ایمن کردن شترها به وسیله بخش اتصال دهنده سم کلستریدیوم بوتولونیوم نوع E در پنج مرحله انجام شد. بعد از خونگیري و اطمینان از ایمن شدن شترها به وسیله تکنیک الیزا، استخراج RNA تام از سلولهاي لنفوسیت جدا شده از خون محیطی با استفاده از کیت Roch انجام و پس از تایید به وسیله الکتروفورز به cDNA تبدیل گردید. براي تکثیر ژن VHH شتري، به منظور افزایش اختصاصیت واکنش از روش Nested PCR استفاده شد. PCR اول با استفاده از cDNA تولید شده و پرایمرهاي اختصاصی انجام و محصول PCR به عنوان الگو براي PCR دوم مورد استفاده قرار گرفت. پرایمرهاي طراحی شده براي مرحله دوم PCR داراي جایگاه برش براي آنزیم Sfi1 بود. بعد از برش آنزیمی وکتور pcomb3x و ژنهاي VHH - محصول PCR ثانویه - به وسیله آنزیم Sfi1، وکتور و ژنهاي آنتی بادي به وسیله ژل Low melting تخلیص شدند.
براي اتصال - - Ligation قطعات DNA فاژمیدي و ژن آنتیبادي، نسبت مولی قطعات وکتور و قطعه VHH بصورت1 به 3 محاسبه شده و واکنش اتصال در دماي 14 درجه توسط آنزیم T4 لیگاز انجام شد. براي انتقال محصول واکنش اتصال به باکتري مستعد - TG1 - از الکتروپوریشن استفاده گردید. این مراحل چندین بار تکرار شد تا از ساخت کتابخانه غنی اطمینان حاصل شود. در این تحقیق براي رهاسازي و تخلیص فاژ نوترکیب، از فاژ کمکی M13 KO7 استفاده شده است. بعد از رهاسازي، فاژها براي انجام مراحل غربالگري ذخیره شدند. مراحل غربالگري در پنج مرحله انجام و براي تایید غنی سازي از طریق غربالگري تکنیک الیزا مورد استفاده قرار گرفت.
براي بدست آوردن ژن VHH با توانایی اتصال بالا به بخش اتصال دهنده سم بوتولیسم نوع E، 20 کلنی از مرحله آخر غربالگري انتخاب شد و بعد از تکثیر فاژمید آنها، براي هر کدام یک واکنش الیزا انجام پذیرفت تا از بین آنها VHH ي که توانایی بالایی براي اتصال به پروتئین مورد نظر ما را دارد، انتخاب گردد. در مرحله بعد 10 کلن از آنهایی که بیشترین OD در مرحله قبل را داشتند، انتخاب نموده و پس از تخلیص پلاسمیدآنها، این پلاسمیدها به سوش TOP10 جهت تولید آنتی بادي به صورت محلول ترانسفر شدند. براي تولید آنتی بادي، باکتري را کشت داده و بعد از رسیدن OD600=0.7 از IPTG براي القاء بیان استفاده گردید. آنتی بادي بیان شده با روشهاي SDS-PAGE و تکنیک Western blot تایید شد و با استفاده از ستون کروماتوگرافی Ni-Nta استخراج گردید. با استفاده از الیزا یک VHH که بیشترین تمایل به توکسین کلستریدیوم بوتولینیم نوع E را داشت انتخاب گردید. - 4و. - 7
نتایج:
بعد از تزریق پنجم آنتی ژن وخونگیري از شترها، براي سنجش تیتر آنتیبادي سرم از روش الیزا استفاده شد.نتایج نشان دهنده این است که شترها نسبت به آنتی ژن مورد نظر ایمن شدهاند - شکل. - 1 بعد از تخلیص RNA و الکتروفورز آن دو باند RNA28s و RNA18s مشاهده شد که نشان می دهد تخلیص به خوبی صورت گرفته است. سپس از این RNA، cDNA ساخته شده و به عنوان Template براي PCR اول مورد استفاده قرار گرفت. در PCR اول سه باند 700-600 و bp 900 دیده می شود - شکل - Pcr 1-2 که باندهاي 600 و bp 700 بعد از تخلیص، به عنوان Template براي مرحله دوم PCR استفاده شد.
در مرحله دوم ژنهاي VHH که 400 bp هستند تکثیر شده - شکل - Pcr 2-2 و بعد از تخلیص براي مرحله اتصال به فاژمید pCOM3X مورد استفاده قرار گرفت.بعد از مرحله پنجم غربالگري و انجام الیزا، نتایج بدست آمده حاکی از آن بود که کتابخانه به غناي لازم رسیده است. در این مرحله تعداد 20 کلنی از کلنی هاي مرحله پنجم غربالگري انتخاب شده و براي هر کدام تست الیزا گذاشته شد - شکل - 3 تا میزان تمایل هر کلنی نسبت به آنتیژن مورد نظر محاسبه شود و از بین آنها کلنی با بیشترین تمایل نسبت به سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع E جداسازي و براي تولید نانوبادي در فاز محلول استفاده شود. همانطور که از تصویر شماره 3 پیداست از میان 20 کلنی انتخاب شده کلنیهاي شماره 8 و 14 بالاترین OD را نشان می دهد.
