بخشی از مقاله
چکیده
یک روش ساده و موثر باززایی نوساقه می تواند موجب تسهیل در انتقال ژن به چغندرقند گردد. در این تحقیق تکثیر جوانه انتهایی چغندرقند در تیمارهاي هورمونی مختلف بررسی گردید. کشت جوانه انتهایی در یک میلی گرم BAP بیشترین میزان تکثیر را نشان داد. همچنین تولید جوانه هاي نابجا روي نمونه هاي برگی ژنوتیپ هاي مختلف چغندرقند مورد بررسی قرار گرفت. ژنوتیپ ها تفاوت معنی داري از لحاظ باززایی نوساقه داشتند. دو ژنوتیپ TMU1 و TMU2، بیشترین میزان باززایی نوساقه را نشان دادند که می توان از آنها در دستکاري هاي ژنتیکی استفاده نمود.
واژه هاي کلیدي: چغندرقند، جوانه انتهایی، اندام زایی مستقیم
مقدمه
توسعه روشهاي موثر باززایی از کشت سلول، بافت یا اندام گیاهان، پیش نیاز ضروري دستکاري ژنتیکی گیاهان است. چغندرقند، گیاه حساس به آگروباکتریوم می باشد اما مانع مهم دستکاري ژنتیکی این گیاه فقدان یک سیستم باززایی نوساقه خوب است. بنابراین توسعه یک روش ساده و موثر باززایی نوساقه، می تواند موجب تسهیل در انتقال ژن به چغندرقند گردد. تولید جوانه نابجا از کشت کالوس در تعدادي از ژنوتیپ ها انجام شده است اما فراوانی باززایی نوساقه بسیار کم است .
باززایی مستقیم جوانه بدون مرحله تشکیل کالوس از دمبرگ، پایه جوانه، برگ هاي لپه اي و لایه اپیکوتیل ، و گزارش شده است. در روش باززایی مستقیم جوانه و نوساقه، گیاهان حاصل پایداري ژنتیکی بالایی دارند . فراوانی باززایی نوساقه در این آزمایشات با توجه به نوع ریز نمونه، ژنوتیپ و ترکیب محیط کشت متفاوت می باشد. انتخاب ژنوتیپ هاي با پتانسیل بالاي باززایی نوساقه، می تواند در توسعه روش هاي انتقال ژن موثر باشد. در این تحقیق تاثیر تیمارهاي مختلف هورمونی بر تکثیر جوانه انتهایی چغندرقند و نیز تاثیر ژنوتیپ هاي مختلف بر اندام زایی از نمونه هاي برگی رشد یافته در شرایط درون شیشه بررسی شده است.
مواد و روشها
در این تحقیق از خانواده نیمه فامیلی تک جوانه 9597-P26 چغندرقند استفاده شد. ابتدا بذرها ضدعفونی شده وسپس در محیط کشت MS نصف غلظت عناصر پرمصرف و داراي 3 درصد ساکارز و 0/8 درصد آگار- آگار در داخل ظروف شیشه اي نیم لیتري کشت شدند. پس از 9-14 روز، جوانه هاي انتهایی جدا شده و در ظروف شیشه اي یک لیتري حاوي 100 میلی لیترمحیط کشت داراي مقادیر مختلف هورمونی کشت شدند هرجوانه انتهایی در داخل یک ظرف قرار داده شد.
تعداد ده جوانه انتهایی براي هر تیمار کشت گردید. جوانه هاي انتهایی کشت شده در دماي 25-28°C و شدت نور 5000-6000 لوکس و تناوب نوري 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. نوساقه هاي حاصل از کشت هر جوانه انتهایی، هر ماه جدا شده و به محیط کشت تازه منتقل می شدند. پس از سه ماه، تعداد نوساقه هاي تولید شده از هر جوانه انتهایی شمارش گردید و نتایج آن در قالب طرح کاملا تصادفی تجزیه گردید.
به منظور مطالعه اثر ژنوتیپ در تولید نوساقه هاي نابجا روي برگ هاي تولید شده در محیط کشت حاوي تیمار هورمونی شماره 3، گیاهچه هاي تکثیر یافته از هر جوانه انتهایی بعنوان یک ژنوتیپ در نظر گرفته شد و نمونه هاي برگی به اندازه 3 سانتی متر از محل اتصال دمبرگ و پهنک برگ جدا شده و در محیط باززایی PGoB حاوي یک میلی گرم در لیتر BAP و یک میلی گرم در لیتر NAA کشت شدند و پس از پنج هفته، درصد باززایی نوساقه از 9 ژنوتیپ در سه تکرار تعیین شد. هر تکرار شامل 8 ریزنمونه برگی در 4 پتري دیش یک بار مصرف با قطر 6 سانتی متر بود. پس از تبدیل داده ها با استفاده از sin-1√x، نتایج در قالب طرح بلوک هاي کامل تصادفی با استفاده از نرم افزار MSTATC تجزیه گردید. هر بلوك به فاصله یک ماه اجرا گردید.
نتایج و بحث
کشت جوانه انتهایی در محیط کشت شماره 3، بیشترین باززایی نوساقه را نشان داد که تفاوت معنی داري با سایر تیمارها داشت تکثیر درون شیشه ژنوتیپ هاي چغندرقند از جوانه انتهایی در محیط کشت حاوي 0/25 میلی گرم در لیتر BAP از طریق زیرکشت هاي متعدد قبلا گزارش شده بود که انتقال نوساقه به محیط کشت حاوي 0/5 میلی گرم در لیتر و بیشتر، از هورمون BAP، موجب تولید برگهاي غیر طبیعی و ضخیم می گردد.
اما در این تحقیق نشان داده شد که با انتقال مجدد این نوساقه ها به محیط کشت بدون هورمون، نوساقه برگهاي طبیعی تولید می نماید و با ریشه دار نمودن این گیاهان، می توان گیاه کاملا طبیعی، در گلدان، بدست آورد. کونورد و هینچی گزارش کردند که می توان نوساقه چغندرقند را در محیط کشت حاوي 0/1 میلی گرم BAP نگهداري نموده و از برگ نوساقه ها براي انتقال ژن استفاده نمود. اما نتایج ما نشان داد که با تیمار 0/1 میلی گرم BAP، میزان تکثیر جوانه انتهایی نسبت به تیمار یک میلی گرم در لیتر BAP پایین تر است.
در این تحقیق نشان داده شد که می توان جوانه انتهایی گیاهچه چغندرقند را در محیط کشت حاوي یک میلی گرم در لیتر BAP، کشت و به سرعت تکثیر نمود. در این تحقیق، هر تک جوانه انتهایی که در شرایط درون شیشه کشت شد، شماره گذاري شده و بعنوان یک ژنوتیپ در نظر گرفته شد. ژنوتیپ ها تفاوت معنی داري در باززایی نوساقه داشتند تاثیر ژنوتیپ در باززایی مستقیم نوساقه قبلا گزارش شده است و حتی تک بوته هاي داخل هر لاین چغندرقند از نظر پاسخ به باززایی نوساقه تفاوت دارند. دو ژنوتیپ با شماره هاي 32 و 77 به ترتیب با 85/13 و 67/59 درصد، بیشترین میزان باززایی نوساقه داشتند و به نامهاي TMU1 و TMU2 نامگذاري شدند و به منظور استفاده در دستکاري هاي ژنتیکی حفظ و نگهداري می شوند.
