بخشی از مقاله
چکیده
فسفر پس از نیتروژن مهمترین عنصر ضروري در تغذیه گیاهان محسوب میشود. به طور کلی، بسیاري از ریزجانداران از جمله باکتريها قادرند تا فرمهاي نامحلول فسفر را به فرمهاي قابل استفاده تبدیل کرده و در طول دوره رشد در اختیار گیاه قرار دهند. این مطالعه به منظور جداسازي، شناسایی و ارزیابی کارایی باکتريهاي حلکننده فسفات منطقه ریزوسفر ریشه برنج در سال 1391 اجرا شد. نتایج نشان داد که 17 درصد ایزولههاي جدا شده از ریزوسفر ریشه برنج قابلیت حلکنندگی فسفات - تري کلسیم فسفات - را در محیط کشت داشتند. نتایج تجزیه واریانس وجود اختلاف معنیداري در سطح احتمال یک درصد را بین ایزولهها نشان داد.
همچنین، نتایج مقایسه میانگین بیانگر آن بود که بالاترین شاخص کارایی حلکنندگی فسفات متعلق به ایزولههاي 68 - 152/7 - و - 149/1 - 13 و پایینترین آن متعلق به ایزوله - 111/4 - 70 بود. در ارزیابی ایزولهها مشخص گردید که ایزوله 13 جزء باکتريهاي گرم مثبت و بقیه ایزولهها گرم منفی بودند. نتایج آزمون تولید رنگدانه فلورسانس نشان داد که تنها 7 ایزوله توانستند روي محیط کشت کینگ B تولید فلورسانس نمایند. بررسیهاي تکمیلی جهت امکان استفاده از جدایههاي حلکنندگی فسفات در دست بررسی میباشد.
مقدمه
فسفر بعد از نیتروژن به عنوان دومین و مهمترین عنصر مورد نیاز گیاهان و ریزجانداران بوده و بیشترین نقش آن در فرآیند تولید و انتقال انرژي است - فلاح نصرت آباد و همکاران، . - 1382 خاك علاوه بر محل استقرار گیاه به عنوان منبع بزرگ تأمین آب و مواد معدنی به خصوص فسفر براي گیاهان شناخته شده است، اما تنها بخش بسیار ناچیزي - حدود 0/1 درصد - از این عنصر براي گیاهان قابل استفاده میباشد - زیو و همکاران، . - 2011 علت آن را می توان تثبیت سریع این عنصر در خاك و تبدیل آن به ترکیبات نامحلول - از قبیل فسفات آهن، آلومینیوم، کلسیم و منیزیم - دانست.
شکل هاي مختلف فسفر - آلی و معدنی - در خاك به وسیله خصوصیات طبیعی خاك شامل اسیدیته، کاتیونهاي محلول و تبادلی، نوع ذرات خاك و سطح آنها کنترل میشود - فلاح نصرتآباد و همکاران، . - 1382 تأمین فسفر مورد نیاز گیاه از دو طریق استفاده از کودهاي شیمیایی و زیستی امکان پذیر است. اما مقدار زیادي از فسفر موجود در کودهاي شیمیایی بعد از مصرف در مزارع به آسانی تبدیل به ترکیبات نامحلول شده و از دسترس گیاه خارج میگردند. همچنین، کاربرد این نوع کودها افزایش هزینه تولید را به همراه خواهند داشت.
در چند دهه اخیر کاربرد ریزجانداران حل کننده فسفات - از جمله باکتري ها و قارچها - در قالب کود زیستی به عنوان یک راهحل مناسب براي رفع این مشکل معرفی شد. در این بین، باکتري هاي حل کننده فسفات - PSB - 1 از اهمیت قابل توجهی برخوردارند. این باکتري ها از طریق اسیديکردن، کلاتکردن، تبادلیکردن و معدنیکردن قابلیت آزادسازي فسفر نامحلول و تثبیتشده توسط ذرات خاك را دارند - آرکاند و اسچنیدر، . - 2006 از مهمترین انواع PSBها میتوان به جنسهاي Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Agrobacterium, Serratia, Flavobacterium, Enterobacter , Micrococcus, Azotobacter, Bradyrhizobium, Salmonella, Alcaligenes, Chromobacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Thiobacillus, و Escherichia اشاره کرد.
کارایی باکترهاي حلکننده فسفات به تعامل بین باکتري و خصوصیات منطقه ریزوسفر ریشه گیاه میزبان وابسته است. در نتیجه براي جداسازي PSBها می توان از باکتريهاي منطقه ریزوسفر ریشه گیاه میزبان، کلنیهایی با جمعیت بالا و استقرار مناسب را انتخاب نمود - آرژل و همکاران، . - 2000 بنابراین، هدف از این مطالعه مقدماتی شناسایی، جداسازي و ارزیابی باکتريهاي حل کننده فسفات کارآمد و معرفی جهت بررسی هاي تکمیلی براي رفع مشکل کمبود فسفر گیاه برنج در خاكهایی با قابلیت استفاده فسفر پایین میباشد.
مواد و روشها
نمونهبرداري خاك
تعداد 12 نمونه خاك در ديماه سال 1391 از مزارع مختلف برنج شهرستان ساري 4 - نمونه از هر منطقه؛ مزارع برنج د جهتهاي شمالغربی، غرب و جنوب به طور جداگانه - با حداقل 10 سال سابقه کشت برنج یا تناوب برنج و شبدر جمعآوري شد. از هر مزرعه چند بوته برنج باقیمانده از سال قبل به همراه خاك اطراف ریشه نمونهبرداري و در کیسههاي پلاستیکی قرار گرفت. نمونهها بلافاصله به آزمایشگاه منتقل و در دماي چهار درجه سانتیگراد در یخچال نگهداري شدند.
جداسازي باکتري
براي جداسازي باکتريها، ابتدا 5 گرم خاك از هر نمونه به 45 میلیلیتر آب نمک استریل - کلرید سدیم 0/85 درصد - سوسپانسیون شد. نمونهها بهمدت 2 ساعت بر روي شیکر 150 - دور در دقیقه - در دماي اتاق تکان داده شد. در پایان، رقتهاي تا 10-4 در آب استریل حاوي 100 میلیگرم در لیتر سیکلوهگزیمید تهیه شد . از این رقت 65 میکرولیتر در دو تکرار بر روي محیط کشت آگار غذایی حاوي سوکروز - NAS - پخش شد. تشتکها در دماي 28 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. جداسازي باکتريها بر اساس اندازه، رنگ، ارتفاع کلنی 48 ساعت بعد از زمان کشت انجام شد.
شناسایی باکتريهاي حلکننده فسفات
براي شناسایی و ارزیابی باکتريهاي حلکنندگی فسفات جداسازيشده، هر ایزوله با سه تکرار روي محیط کشت 1PVK - گلوگز 10 گرم، تريکلسیم فسفات 5 گرم، سولفات آمونیوم 0/5 گرم، کلرید پتاسیم 0/2 گرم، سولفات منیزیم 0/2 گرم، کلریدسدیم 0/2 گرم، سولفات آهن 0/0001 گرم، سولفات منگنز 0/0001 گرم، عصاره مخمر 0/5 گرم و آگار 10 گرم در لیتر - کشت داده شد - پیکوفسکی، . - 1948 تشتکها در دماي 28 درجه سانتیگراد به مدت 5 روز نگهداري گردیدند.
براي شناسایی باکتريهاي حل کننده فسفات از خصوصیات شفافسازي محیط پیرامون کلنی آنها استفاده شد. کارایی حلکنندگی2 این باکتريها از طریق نسبت قطر هاله شفاف3 به قطر رشد کلنی4 ضربدر 100 محاسبه گردید. هر چه عدد بدست آمده بزرگتر باشد نشاندهنده کارایی بالاتر باکتري براي حلکردن تري کلسیم فسفات میباشد - راماچاندران و همکاران، . - 2003 بعد از شناسایی باکتريهاي حلکننده فسفات آزمایشهاي مقدماتی از قبیل آزمون هیدروکسید پتاسیم - %3 - - ساسلو و همکاران، - 1982 براي بررسی واکنش گرم باکتريها انجام شد. همچنین، کشت روي محیط کشت کینگ B - کینگ و همکاران، - 1954 و EMB بهترتیب براي شناسایی اولیه جنسهاي باکتري فلورسانس5 و اینتروباکتر6 انجام شد.
نتایج و بحث
در مجموع 100 عدد ایزوله باکتري از منطقه ریزوسفر ریشه برنج جداسازي و خالصسازي شد. جهت شناسایی اولیه جدایهها، آزمونهاي اولیه معمولی انجام شد. توانایی باکتريها براي حلکنند گی فسفات روي محیط کشت PVK مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که 17 ایزوله قادر به حلکردن تريکلسیم فسفات نامحلول در محیط کشت میباشند. نتایج تجزیه واریانس از نظر شاخص کارایی حلکنندگی فسفات در سطح احتمال 1 درصد بین ایزوله ها اختلاف معنیداري وجود داشت.
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که بالاترین کارایی حلکنندگی فسفات متعلق به ایزوله هاي 68 و 13 بهترتیب با کارایی 152/7 و 149/1 و پایینترین آن متعلق به ایزوله 70 با کارایی 111/4 بود. نتایج آزمون هیدروکسید پتاسیم - %3 - نشان داد که به استثناي یک ایزوله گرم مثبت، بقیه ایزولهها گرم منفی بودند - جدول . - 1 همچنین، پس از کشت 48 ساعته ایزولهها روي محیط کشت کینگ B نتایج حاکی از آن بود که تنها 7 ایزوله توانستند تولید فلورسانس نمایند - جدول . - 1 در ضمن هیچ یک از ایزولهها روي محیط کشت EMB رنگ سبز متالیک تولید نکردند.
بهطورکلی، ریزجانداران جداسازيشده از منطقه ریزوسفر ریشه گیاه میزبان ممکن است نسبت به ریزجانداران جداسازيشده از منابع یا مناطق دیگر بهتر با گیاه میزبان سازگاري داشته باشند، که علت آن را میتوان به سازگاري باکتريها با سیستم ریشه گیاه و شرایط محیطی منطقه نسبت داد - گوپالاکریشنان و همکاران، . - 2010 بنابراین، نتایج این مطالعه میتواند جهت معرفی مناسبترین جدایههاي باکتريهاي حلکننده فسفات به منظور امکان استفاده از آنها در تولید کودهاي زیستی قابل استفاده در مزارع برنج شمال کشور مورد استفاده قرار گیرد.
