بخشی از مقاله
مقدمه:
کمبودفسفر بعد از نیتروژن معمولاً به عنوان دومین عامل محدودکنندهی رشد گیاهان شناخته میشود که به دو فرم آلی و معدنی در خاک انباشته میشود - . - S.woo et al. 2010فسفر در تکامل ریشهها، استحکام، دوام ساقه، تشکیل گل-ها و دانهها، بلوغ و تولید محصولات، تثبیت نیتروژن در لگوم، کیفیت محصولات و مقاومت نسبت به بیماریهای گیاهان دخالت میکند . - A.khan et al. 2009 - فسفر یکی ازغیرمحرکترین و غیرقابل دسترسترین عناصر بوده، لذا در اکثر خاکها باعث کاهش تولیدات کشاورزی میگردد. مقدار فسفر خاک از 2 تا 5 درصد نوسان داشته به همین دلیل، غلظت فسفر در یاختههای گیاهی بسیار اندک - حدود 2 درصد - است - م.ملکوتی.. - 1378 برای بهبود محصولات گیاهی روش مرسوم به کار بردن مقادیر زیادی کودهای فسفره در خاک است. 75-90 درصد کودهای فسفره مصرف شده در خاک در حضور Al وFe و Ca رسوب میکنند - . - P.Mahantesh. 2011 مصرف بی رویهی کودهای فسفاته، گذشته از هزینه های ارزی گزاف جهت خرید کود از خارج از کشور، اثرات زیانباری نیز دارد.
از جمله این اثرات می توان به مسمومیت فسفری ناشی از جذب بیش از حد فسفر معدنی و بالا رفتن غلظت آن در بافتهای گیاهی و به هم خوردن تعادل عناصر غذایی، کاهش عملکرد محصول، کاهش جذب مس، غیر متحرک شدن آهن در خاک ، ممانعت از جذب آهن توسط ریشه، مختل کردن متابولیسم روی درون گیاه، آلودگی خاک به کادمیوم، تنزل کیفیت محصولات و آلودگی آب ها به فسفر را نام برد . - M.Alam,2009 - یکی از راههای تأمین فسفر مورد نیاز گیاهان بهره گیری از توان زیستی خاک و استفاده از میکروارگانیسمهای حل کنندهی فسفات میباشد . - Gyaneshwar - مدارکی مبنی بر نقش میکروارگانیسمهای ریزوسفری در انحلال فسفات معدنی به سال 1903 برمیگردد - ساریخانی و همکاران. . - 1390 میکروارگانیسمها از طریق معدنی کردن فسفر آلی و انحلال فسفاتهای رسوب یافته فراهم سازی فسفر برای گیاهان را افزایش میدهند.
باکتریها، قارچها و اکتینومیستها توانایی حلکنندگی را دارند اما باکتریها در مقایسه با قارچها و اکتینومیستها در انحلال فسفر بسیار موثرترند و جمعیت بالایی را به خود اختصاص میدهند. مهمترین باکتریهای حل کنندهی فسفات از جنس سودوموناس و باسیلوس می باشند. این میکروارگانیسمها با اکسیداسیون ناقص قندها و مواد پلی ساکاریدی که توسط ریشه گیاه ترشح میشوند، اسیدهای آلی مانند گلوکونیک اسید، اسید اگزالیک و اسید سیتریک تولید مینمایند . - H.Han.2006 - هدف از این پژوهش جداسازی و شناسایی باکتریهای حلکننده فسفات از ریزوسفر کلم از روستای عقیلی واقع در شهرستان شوشتر و معرفی سویه برتر میباشد.
مواد و روشها
نمونههای خاک ریزوسفر کلم دربهمن ماه 1392 از 3 ناحیهی زمین کشاورزی واقع در روستای عقیلی شهرستان شوشتر جمعآوری شد و به آزمایشگاه تحقیقاتی میکروبیولوژی دانشکده علوم دانشگاه شهید چمران اهواز منتقل شد. برای غنیسازی و غربالگری باکتریهای حلکننده فسفات از محیط کشت Pikovskayas broth و pikovskayasagar استفاده شد. این محیط کشت به صورت سنتتیک میباشد که شامل گلوکز10g، تری کلسیم فسفات 5 g، آمونیوم سولفات 0/5g ، کلراید سدیم 0/2 g ، کلراید پتاسیم 0/2 g منیزیم سولفات 0/1g ، عصاره مخمر 0/5g، منگنز سولفات g 0/002، سولفات آهن0/002g و آگار 15 g میباشد 10 . - C. Shekhar.1999 - گرم از هر نمونه وزن شد و به 90 میلی لیتر آب مقطر استریل اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دور180 rpm شیک شد 1. - L. Hui et al. 2011 - میلی لیتر از مایع رویی برداشته شد و درون ارلنهای حاوی محیط کشت غنیسازی ریخته شد، ارلنها به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه و دور180 rpm انکوبه شدند.
100 میکرولیتر از مایع رویی موجود در محیط براث برداشته شد و روی Pikovskayas agar کشت 4 منطقهای داده شد. پلیتها در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه شدند. نواحی شفاف اطراف کلنی نشاندهندهی حضور باکتریهای حلکننده فسفات میباشند. کلنیها با هاله شفاف از محیط کشت جدا شدند و برای خالصسازی 3 تا 4 بار در محیط تازه کشت شدند. . - v.Ramani. 2011 - تعیین شاخص - SI - و راندمان - PSE - حلکنندگی فسفات در جدایهها: سویههای جدا شده را به صورت نقطهای در مرکز محیط کشت Modified Pikovskayas کشت دادیم، پلیتها در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز انکوبه شدند . - v.Ramani. 2011 - سپس قطر کلنی و قطر هاله شفاف اندازه گیری شد و با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد . - M.A.Qureshi et al. 2012 -
:Z قطر هاله شفاف، :C قطر کلونی
شناسایی فنوتیپی جدایههای منتخب: در این مرحله از تستهای بیوشیمیایی برای شناسایی جدایههای منتخب استفاده شد. از جمله تستهای به کار رفته شامل رنگ آمیزیگرم، اسنات، لاکتوز، احیا نیترات، اکسیداز، کاتالاز، سیترات، تخمیر گلوکز، لایزین دکربوکسیلاز و000بوده است. قابلیت تثبیتکنندگی نیتروژن در جدایههای منتخب: به منظور بررسی این توانمندی در جدایههای منتخب از محیط کشت باکتریایی فاقد نیتروژن Dobereiner استفاده گردید. وجود ماده رنگزای برم تیمولبلو در این محیط باعث میشود تا در صورت داشتن فعالیت اسیدی رنگ محیط کشت از رنگ سبز به رنگ زرد تغییر یابد. جدایههای منتخب به صورت 4 منطقهای کشت داده شدند و پلیتها به مدت 24-48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند
نتایج:
غربالگری و جداسازی باکتریهای حلکننده فسفات به واسطه ایجاد هاله شفاف در اطراف کلنیها صورت گرفت. بعد از خالص سازی در حدود 10 کلنی که از نظر مورفولوژی، سایز کلنی و رنگ کلنی متفاوت بودند جدا شدند.کلنیها از نظر قابلیت حلکنندگی با یکدیگر مقایسه شدند. قطر کلنی و قطر کل - قطرهاله شفاف و قطر کلنی - بر حسب میلی متر اندازه گیری شد، شاخص حلکنندگی و تاثیر حلکنندگی فسفات برای معرفی جدایههای برتر محاسبه شد که در جدول 1 نتایج آن نشان داده شده است. جدایههایی که قابلیت حلکنندگی بالاتری داشتند به عنوان جدایههای برتر انتخاب شدند. شناسایی بر اساس ویژگی-های بیوشیمیایی صورت گرفت. نتایج مربوط به بررسی خصوصیات فنوتیپی سویههای حلکنندهی فسفات در جدول 2 نشان داده شده است. باتوجه به نتایج بدست آمده،4 جدایه منتخب متعلق به جنسهای کلبسیلا، ائروموناس و انتروباکتر میباشند؟2 جدایهی Rk31 و Aeromonas veronii RK14 و 2 جدایهی RK32 و RK23 به ترتیب Enterobacter pneumoniae و Klebsiella pneumoniae نامگذاری شدند.
بحث:
باتوجه به نیاز ضروری سلولهای زنده به فسفر توجه بیشتر پژوهشگران بر گونههای میکروبی فعال در زمینه تولید اسیدهای آلی، تولیدکننده فسفاتازها معطوف بوده است که با دست یابی به یک گونهی مناسب بتوان از آن در حیطه-هایی چون کودهای بیولوژیک برای گیاهان و پروبیوتیک برای دام و طیور استفاده نمود - ساریخانی و همکاران.. - 1390
