بخشی از مقاله
مقدمه
برنج به عنوان یکی از محصولات مهم و راهبردي زراعی کشور از گذشتههاي دور در سبد مصرفی خانوادههاي ایرانی از اهمیت ویژه ایی برخوردار بود . امروزه با توجه به کمبود تولید و افزایش هزینههاي نهادههاي مصرفی در بخش کشاورزي - از قبیل کود و سم - و همچنین افزایش آلودگیهاي زیستمحیطی، استفاده از کودهاي زیستی در جهت بهبود تأمین عناصر غذایی براي رسیدن به کشاورزي پایدار را امري اجتنابپذیر ساخته است. فسفر دومین و مهمترین عنصر مورد نیاز گیاهان و ریزجانداران بوده و بیشترین نقش آن در فرآیند تولید و انتقال انرژي است - فلاح نصرتآبادي و همکاران، . - 1382 بهطور کلی، در اکثر خاك ها فسفر معدنی و یا منابع تأمین کننده فسفر براي گیاه به حد کافی وجود دارد، اما تنها بخش بسیار ناچیزي - حدود 0/1 درصد - از این عنصر براي گیاهان قابل استفاده میباشد - زیو و همکاران، . - 2011
علت آن را میتوان تثبیت سریع این عنصر در خاك و تبدیل آن به ترکیبات نامحلول - از قبیل فسفات آهن، آلومینیوم، کلسیم و منیزیم - دانست - فلاح نصرتآبادي و همکاران، . - 1382 در چند دهه اخیر کاربرد ریزجانداران حلکننده فسفات - از جمله باکتريها و قارچها - در قالب کود زیستی به عنوان یک راهحل مناسب براي رفع این مشکل معرفی شده است. در این بین، باکتري هاي حلکننده فسفات - PSB - از اهمیت قابل توجهی برخوردارند. این ریزجانداران از طریق اسیدي کردن، کلات کردن، تبادلیکردن و معدنیکردن قابلیت آزادسازي فسفر نامحلول و تثبیتشده توسط ذرات خاك را دارند - آرکاند و اسجنیدر، . - 2006 کارایی PSBها به تعامل بین باکتري و خصوصیات منطقه ریزوسفر ریشه گیاه میزبان وابسته است. در نتیجه براي جداسازي این گونه از باکتريها میتوان از باکتريهاي منطقه ریزوسفر ریشه گیاه میزبان، کلنیها با جمعیت بالا و استقرار مناسب استفاده نمود - آرژل و همکاران، . - 2000
در مجموع، پس از بررسی 63 مورد از مقالات ارائه شده در همایشهاي ملی و مجلات علمی و پژوهشی کشور مشاهده شد که تنها 10 درصد از مطالعات صورت گرفته در این حوزه در خصوص جداسازي و شناسایی باکتريهاي حل کننده فسفات بوده است. در صورتی که براي رسیدن به موفقیت و خودکفایی در زمینه تولید کودهاي زیستی، انجام مطالعات اولیه و پایه اي - یعنی جداسازي و شناسایی - از جمله مهمترین مراحل است که متأسفانه در کشور کمتر مورد توجه قرار گرفته شده است. بنابراین، به دلیل عدم وجود مطالعات جامع در خصوص شناسایی و جداسازي PSBها از منطقه ریزوسفر ریشه برنج در کشور، هدف این مطالعه مقدماتی شناسایی، جداسازي وارزیابی PSB هاي کارآمد و معرفی جهت بررسیهاي تکمیلی براي رفع مشکل کمبود فسفر گیاه برنج در خاكهایی با قابلیت استفاده فسفر پایین در نظر گرفته شد.
مواد و روشها
تعداد 46 نمونه خاك در بهمنماه سال 1391 از مزارع برنج استان مازندارن با حداقل 5 تا 10 سال سابقه کشت برنج یا تناوب برنج با شبدر و جو جمعآوري شد. از هر مزرعه چند بوته برنج باقیمانده از سال قبل به همراه خاك اطراف ریشه نمونهبرداري و در کیسههاي پلاستیکی استریل قرار گرفت. نمونهها بلافاصله به آزمایشگاه میکروبیولوژي، پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوري کشاورزي طبرستان منتقل و در دماي 4 درجه سانتیگراد تا انجام مراحل بعدي آزمایش نگهداري شدند. براي جداسازي باکتريها، ابتدا یک گرم خاك از هر نمونه به نه میلیلیتر آب نمک استریل - کلرید سدیم 0/85 درصد - در فالکونهاي 15 میلیلیتري - استریل شده - اضافه و سوسپانسیونی به نسبت - 1:10 - تهیه گردید.
سوسپانسیونها به مدت دو ساعت روي شیکر 150 - دور در دقیقه - و در دماي اتاق تکان داده شدند - فلاح نصرتآبادي و همکاران، . - 1382 در پایان، رقت دهی تا 10-4 یا 10-5 در آب استریل حاوي 100 میلیگرم در لیتر سیکلوهگزیمید انجام شد. از این رقت به مقدار 65 میکرولیتر با دو تکرار بر روي تشتک±هاي - با قطر 9 سانتیمتر - حاوي محیط کشت آگار غذایی سوکروزدار - NAS - پخش شد. تشتکها در دماي 29 1 درجهسانتیگراد نگهداري شده و جداسازي باکتريها بر اساس اندازه، رنگ و ارتفاع کلنی، 48 ساعت بعد از زمان کشت انجام شد. براي شناسایی و ارزیابی باکتريهاي حلکننده فسفات، هر ایزوله به طور جداگانه بر روي محیط کشت پیکوفسکی PVK - - 1948 - حاوي گلوگز 10 گرم، تريکلسیم فسفات 5 گرم، عصاره مخمر 0/5 گرم، سولفات آمونیوم 0/5 گرم، کلرید پتاسیم 0/2 گرم، کلرید سدیم 0/2 گرم، سولفات منیزیم 0/1 گرم، سولفات آهن 0/0003 گرم، سولفات منگنز0/0003± گرم و آگار 10 گرم در لیتر با اسیدیته ثابت 7 - محیط کشت جامد - کشت داده شد.
تشتکها در دماي 29 1 درجهسانتیگراد به مدت 5 روز نگهداري شدند. براي شناسایی باکتري هاي حلکننده فسفات از خصوصیات شفافسازي محیط پیرامون کلنی آنها استفاده گردید. بعد از شناسایی و جداسازي این گونه از باکتريها از محیط کشت جامد پیکوفسکی، براي ارزیابی میزان قابلیت آنها به عنوان باکتري هاي حلکننده فسفات، هر ایزوله به صورت±جداگانه در محیط کشت مایع پیکوفسکی به مدت 100 ساعت روي شیکر 100 - دور در دقیقه - و در دماي 29 1 درجه سانتیگراد کشت داده شد 25 - میلیلیتر محیط کشت مایع در فالکونهاي 50 میلیلیتري استریل شده با دو تکرار - . در پایان، 2 میلیلیتر محیط کشت از هر فالکون برداشت و به ویالهاي 2 میلیلیتري انتقال داده شد. سپس براي حذف باکتري و مواد جامد موجود در محیط کشت، ویالها به مدت 10 دقیقه، در 12000 دور در دقیقه و در دماي 25 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شدند، محلول شفاف بالاي هر ویال به ویالهاي جدید منتقل شد. در نهایت فسفر قابل استفاده با روش پیشنهاد شده توسط واتانابی و السن - 1965 - اندازهگیري شد. براي تجزیه و تحلیل داده ها از نرم افزار آماري SAS نسخه 9/1 استفاده گردید.
نتایج و بحث
در مجموع 300 ایزوله باکتري از منطقه ریزوسفر ریشه برنج جداسازي و خالصسازي شد. جهت شناسایی اولیه، توانایی باکتري ها براي حلکنندگی فسفات روي محیط کشت PVK مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که تنها 18 درصد از ایزولهها 54 - ایزوله - قادر به تولید هاله شفاف - حلکردن تريکلسیم فسفات نامحلول - در محیط کشت جامد بودند. بعد از کشت این ایزولهها در محیط کشت مایع، نتایج تجزیه واریانس نشان داد که از نظر مقدار حلکنندگی فسفات بین ایزولهها جداسازيشده در سطح احتمال یک درصد اختلاف معنیداري وجود داشت. تجزیه کلاستر، ایزولههاي حلکننده فسفات را بر اساس مقدار و قدرت حلکنندگی فسفات در چهار گروه خیلی خوب 250 < - میکروگرم در میلیلیتر - ، خوب 250 > - و 115 < میکروگرم در میلیلیتر - ، متوسط 115 > - و 54 < میکروگرم در میلیلیتر - و ضعیف 50 > - میکروگرم در میلیلیتر - دستهبندي نمود. در جدول 1 و شکل 1 مقدار حلکنندگی فسفات هر یک از ایزولهها و گروه بندي آن ها - تجزیه کلاستر - نشان داده شده است.
بر اساس نتایج ارائه شده در جدول شماره یک تنها 3، 9، 5 و 37 ایزوله به ترتیب در گروه اول، دوم، سوم و چهارم قرار گرفتند. در همین زمینه نیز گوپالایشنان و همکاران - 2010 - اظهار داشتند که ریزجانداران جداسازيشده از منطقه ریزوسفر ریشه گیاه میزبان ممکن است نسبت به ریزجانداران جداسازيشده از منابع یا مناطق دیگر بهتر با گیاه میزبان سازگاري داشته باشند، که علت آن را میتوان به سازگاري باکتريها با سیستم ریشه گیاه و شرایط محیطی منطقه نسبت داد. بنابراین، از نتایج این مطالعه میتوان در جهت معرفی مناسبترین جدایههاي از باکتريهاي حلکننده فسفات با قدرت حلکنندگی بالا - به عنوان مثال گروه اول از باکتري هاي جداسازي شده - به منظور استفاده از آنها مطالعات بعدي از جمله در تولید کودهاي زیستی قابل استفاده در مزارع برنج شمال کشور استفاده نمود.
