بخشی از مقاله
چکیده
از خاک ریزوسفری مزرعه ای واقع در بردسیر استان کرمان نمونه برداری صورت گرفت و 28 ریزوباکتر، جداسازی شدند. با توجه به نتایج آزمونهای محلول ساختن فسفات و روی، تست احیای نیترات، تولید آمونیوم و تثبیت نیتروژن و مقاومت به عوامل محیطی، یک ریزوباکتر انتخاب و بر اساس نتایج مولکولی، با عنوان گونه باسیلوس 3152 شناسایی شد. باکتری فوق قادر به محلول ساختن فسفات بود. گونه باسیلوس 3152 دارای میزان ظرفیت محلول سازی فسفات 180 درصد و فاقد توانایی محلول ساختن روی گزارش گردید.
تست احیا نیترات در باکتری فوق مثبت و قابلیت تولید آمونیوم منفی و تثبیت نیتروژن مثبت گزارش شد. در آزمون گلدان با استفاده از بذر گیاه ذرت و توسط آنالیز آماری مشخص شد که افزایش طول ساقه، طول ریشه، وزن خشک ریشه و وزن خشک ساقه در اثر گونه باسیلوس 3152 واجد تغییرات مثبت معنیداری در مقایسه با کنترل بود. داده ها و نتایج حاصل از این پژوهش این فرضیه را تایید مینمایدکه ایزوله فوق دارای توانایی قابل توجهی در افزایش رشد گیاهی ذرت و به احتمال قوی برگیاهان دیگر است و به رشد گیاهانی که در شرایط کمبود فسفر قرار دارند کمک موثری مینماید. به علاوه توانایی ریزوباکتر مزبور در زمینهای کشاورزی دارای تغییرات دما و نمک و اسیدیته بسیار ارزشمند و کاربردی میباشد.
مقدمه
با افزایش روزافزون جمعیت، تامین غذا به عنوان یکی از مهم ترین چالش های پیش رو خواهد بود. انقلاب سبز اگر جه توانست انسان را در تامین غذای مورد نیازش یاری دهد ولیکن با روند رو به رشد جمعیت و نیاز به مواد غذایی بیش تر، ضرورت نیاز به انقلاب سبز دیگری با تاکید بر رعایت اصول زیست محیطی و حفظ منابع و پایداری آن ها بیش تر احساس می شود. به طوری که تا 20 سال آینده قادر به تامین افزایش 50 درصدی مواد غذایی باشد . - Khan et al, 2007 - انقلاب سبز که با معرفی و عرضه کودهای شیمیایی شکل گرفت، در کنار افزایش تولید مخاطراتی را برای محیط ریست و بشر به دنبال داشت.
لذا بشر را بر آن داشت که برای حفظ تولید وحفظ منابع پایه خود با پایه ریزی کشاورزی پایدار با تاکید بیش تری بر پتانسیل ها و توان های زیستی خاک از روش هایی استفاده نماید که با طبیعت سازگارتر باشد و تعادل زیست بومی خاک در محیط را حفظ نماید. در این رهگذر روی آوردن به کودهای زیستی به جای کودهای شیمیایی جایگزینی مناسب به نظر می رسد. در نیمه قرن گذشته بیش ترین توجه به باکتری های تثبیت کننده ازت معطوف بوده است.
اما در دو دهه اخیر استفاده از باکتری های مفید دیگری برای رفع نیازهای تغذیه ای و احیای فلور طبیعی خاک تحت عنوان مهندسی ریزوسفر1 نیز مورد توجه پژوهشگران این رشته بوده است - ساریخانی و همکاران،. - 1393 فسفر یکی از عناصر غذایی مهم برای گیاهان می باشد که در خاک فراهمی کمی دارد و در خاک بع دو شکل آلی و معدنی یافت می شود - قدس علوی و همکاران،. - 1392 با وجودی که فسفر خاک های مختلف از 400 تا 1000 میلی گرم در کیلوگرم گزارش شده است، ولی گیاهان می توانند این عنصر را فقط به صورت آنیون های یک ظرفیتی H2PO42- یا دو ظرفیتی Hpo42- جذب نمایند که در اغلب موارد غلظت آن در خاک بسیار پایین است.
این عنصر در ساختمان هسته و غشای سلول نقش ویژه دارد . از طرفی یون های معدنی مانند آلومینیوم، آهن و کلسیم و یا اسیدهای آلی فسفر را در خاک تثبیت می کنند که گیاه نمی تواند این فسفر تثبیت شده را جذب کند . - Omar et al, 2014 - باکتری های افزایش دهنده رشد گیاهی - PGPR - 2 موجب افزایش رشد و مقاومت گیاهان در کشاورزی می شوند که تعداد زیادی از انواع این باکتری ها در ارتباط با ریزوسفر گیاه می باشند. این باکتری ها برای رشد و افزایش بازده و محصول گیاه مفید می باشند - ساریخانی و همکاران، . - 1393 برخی از باکتری های افزایش دهنده رشد گیاهی موجود در خاک تحت عنوان باکتری های حل کننده فسفات 3 شناخته شده اند که دارای توانایی انحلال فسفات معدنی از طریق مکانیسم های مختلف می باشند.
- Kundu et al, 2009 - استفاده از میکروارگانیسم هایی که به عنوان کود زیستی4 عرضه می شوند کمک به کاهش هزینه های استفاده از کودهای شیمیایی فسفره می نماید . - Kucey,1989 - کود های شیمیایی به عنوان ابزاری برای رسیدن به حداکثر تولید در واحد سطح استفاده می شوند. کشاورزان به طور مداوم تلاش می کنند تا با رفع کمبود عناصر غذایی خاک و مدیریت صحیح، تولید محصول را به حد بالقوه ژنتیکی نزدیک کنند.
با این وجود مشکلات اقتصادی ناشی از افزایش رو به رشد هزینه کودهای شیمیایی از یک سو و مسایل زیست محیطی مرتبط با مصرف غیر اصولی این کودها از سوی دیگر تفکر استفاده از شیوه های زیستی برای تقویت رشد محصولات را قوت بخشیده است - بهاری ساروی و پیردشتی، . - 1391 در پژوهش پیش رو اهداف کاربردی مدنظر قرار گرفته و بر اساس آن آزمون ها و آزمایش های مورد نیاز صورت پذیرفته که به شرح زیر می باشند:
الف - نمونه برداری از خاک ریزوسفری و ایزوله کردن باکتری های موجود در آن.
ب - مشخص نمودن قابلیت محلول ساختن فسفات توسط این باکتری ها.
ج - تعیین هویت و مشخص نمودن خصوصیات باکتری های با قدرت مناسب در محلول ساختن فسفات.
د - بررسی برخی از خصوصیات استرس محیطی بر روی باکتری های انتخاب شده.
ه - بررسی قدرت افزایش رشد گیاه انتخابی از مرحله بذر تا گیاهچه به کمک باکتری های انتخاب شده در مرحله گلدان.
روش تحقیق
این آزمایش در زمینی واقع در شهرستان بردسیر از استان کرمان انجام شد. نمونه گیری از خاک ریزوسفری مزرعه ای واقع در مکان مذکور، در منطقه ای دور از جاده و آلودگی های محیطی صورت گرفت. نمونه گیری های فوق از ریزوسفر سه بار تکرار شد تا به تعداد کافی از کلنی های مختلف دست یافته شود . - Mehmet and et al,2010 -
غنیسازی
نمونه خاک زراعی به بطری خاک حاوی محیط کشت تامپسون- اسکرمان1 واجد گلوکز و فاقد نیتروژن طی مراحلی به شرح زیر افزوده شد. یک گرم از خاک ریزوسفری تهیه شده به صورت آسپتیک به محیطهای کشت موجود افزوده و سپس درب بطریها را بسته و با حرکت دادن بطریها، خاک و محیط کشت با هم مخلوط گردیدند. جهت ایجاد حداکثر سطح تماس با هوا، بطریها بهصورت افقی با درب نیمبسته در گرمخانه با دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 4 تا 7 روز گذاشته شدند. یون فلزی مولیبدیوم نیز به محیط کشت افزوده شد و آنزیمهای نیتروژنازی باکتریها که در فرآیند تثبیت نیتروژن شرکت داشتند فعال شدند. در ادامه از باکتریهایی که روی سطح محیط مایع رشد کرده بودند از هر محیط یک لام با رنگآمیزی گرم تهیه و بهصورت میکروسکوپی مشاهده شد. - Thompson and
کشت بر روی محیط جامد
پس از مشاهده نتیجه مثبت از کشت مایع، تلقیح بر روی محیطهای جامد فاقد آهن و نیتروژن به شرح زیر صورت پذیرفت: پس از گذشت 4 تا 7 روز از گرمخانهگذاری، انتقال بطریهای واجد محیطهای مایع به هود میکروبیولوژی بهگونهای صورت گرفت که تا حد ممکن از بهم خوردگی نمونه جلوگیری شود. سپس به اندازه یک لوپ از سطح محیط مایع برروی یک لام انتقال داده شد و با درشتنمایی حداکثر توسط میکروسکوپ مشاهده گردید . - Thompson and Skerman,1979 - ردیابی قابلیت تثبیت نیتروژن در باکتریهای ایزولهشده توسط محیط کشتهای جنسون و بورک یک کلنی از باکتری ایزولهشده مورد نظر در 5 میلیلیتر لوریا بورنتیبراث تلقیح گردید و پس از 24 ساعت در هوادهی ناشی از شیکر، به مدت 10 دقیقه در 8000 دور بر دقیقه در سانتریفیوژ قرار گرفتند.
ابتدا سه بار با نرمالسالین استریل عمل شستشو انجام شد و در ادامه یک میلیلیتر نرمالسالین استریل به رسوب باکتری افزوده گردید و پس از بهمزدن لوله، سوسپانسیون میکروبی حاصل گردید. در خاتمه 20 میکرولیتر از سوسپانسیون بهدستآمده بهصورت لکهگذاری به محیطکشتهای فاقد نیتروژن افزوده شد. محیط-کشتهای جنسون ، بورک در دمای 30 درجه سانتیگراد گذاشته شدند. همه محیط کشتهای نامبرده از شرکتهای مدیا تهیه شدند و جهت تهیهی آنها از آب مقطر و نوبلآگار استفاده گردیده است. رشد باکتری در زمانهای 24، 48، 72 و 96 ساعت ارزیابی شد. بهمنظور ساخت 1 لیتر محیط کشت، بهطور جداگانه مقدار گرم محیط ذکر شده بر روی برچسب قوطی برداشته شد و به 1000 میلیلیتر آبمقطر اضافه گردید.
