بخشی از مقاله
چکیده
به منظور جداسازی باکتری های ریزوسفری مقاوم به شوری درختان پسته استان کرمان، 20 نمونه به طور مرکب از ناحیه ریزوسفر درختان پسته تهیه، واز 4 نمونه که درصد کلنیزاسیون و هدایت الکتریکی بالاتری داشتند 27 جدایه انتخاب و جداسازی و جدایه ها از نظر میزان تحمل به شوری، رشد و تست گرم مورد ارزیابی قرار گرفتند.
مقدمه
پسته با سطح زیر کشت حدود 430 هزار هکتار از مهمترین محصولات کشاورزی است که حدود 80 درصد سطح زیر کشت و تولید آن مربوط به استان کرمان میباشد
خاک یک سیستم ناهمگن است که ترکیب مواد معدنی، شوری، مقدار موادآلی، درجه حرارت، مقدار آب، شرایطاقلیمی، جغرافیایی و تاثیرات انسانی تعیین کننده نوع جانداران موجود در آن می-باشد
بخشی از خاک که فعالیت ریزجانداران در آن بیشتر است را ریزوسفر - - 5 مینامند. ریزوسفر لایه نازکی از خاک اطراف ریشه است 1 - تا3 میلی متر - که موجودات زنده در آن ناحیه از نظر کمی و کیفی تحت تاثیر فعالیت ریشه مانند تنفس و ترشحات ریشه ای قرار دارند
به گروهی از باکتریهای مفید ریزوسفری خاک که باعث افزایش رشد گیاه میشوند، باکتریهای محرک رشد گیاه گفته میشود. این باکتریها میتوانند با استفاده از روشهای مختلف شاملانحلال ترکیبات کم- محلول و نامحلول عناصر غذایی و در نتیجه افزایش فراهمی آنها، تثبیت نیتروژن، کنترل بیماریگرهای گیاهی با تولید سیانید هیدروژن، تولید ترکیبات ضد میکروبی و رقابت برای جذب عناصر غذایی، تولید سایدروفور،افزایش تحمل گیاهان به تنش شوری، خشکی و سمیت عناصر و تولید هورمونهای گیاهی مانند ایندول استیک اسید باعث افزایش رشد گیاه شوند
باکتریهای مختلفی در فهرست انواع باکتری های محرک رشد قرار گرفتهاند و متداول ترین انواع شناسایی شده مربوط به جنس های آزوسپریلیوم، ریزوبیوم، سودوموناس، باسیلوس، ازتوباکتر، فلاووباکتریوم و... میباشد
مواد و روش ها
تهیه نمونه
نمونه برداری خاک از باغات پسته، با شرایط متفاوت از نظر شوری و حاصلخیزی خاک در شهرستان کرمان و رفسنجان انجام شد.از هر باغ یک نمونه مرکب شامل قطعاتی از ریشه و خاک چسبیده بهآن تهیه و به آزمایشگاه منتقل شد و هدایت الکتریکی نمونهها قرائت شد.
اندازه گیری درصد کلنیزاسیون
ابتدا ریشههارا کامل شسته، نمونههای ریشه درون هیدروکسید پتاسیم قرار داده شدند و سپس به منظور رنگ بری ریشهها هیدروکسید پتاسیم را با آب مقطر چندین بار شسته و نمونهها را با آب اکسیژنه قلیایی به مدت ده دقیقه پوشانده و سپس با آب مقطر شسته شدند. بعد از این مرحله نمونهها با هیدروکلرید به مدت 3 دقیقه پوشانده شدند. بعد از خالی کردن نمونهها با محلول رنگ آمیزی تریفان بلو چندین ساعت در آزمایشگاه نگه داری شدند تا اینکه اجزا قارچ - وزیکول،هیف،آربوسکول - در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده باشد.
جداسازی باکتری های ریزوسفری
پس از اندازه گیری درصد کلنیزاسیون میکروبی وهدایت الکتریکی نمونه ها، 4 نمونه - جدول - 1 درصد کلنیزاسیون و نیز هدایت الکتریکی بیشتری داشتند،انتخاب شدند. در این مرحله از هر یک از نمونه های ریزوسفری سریال رقت 10 -1 - الی -6 - 10 تهیه و سپس یک میلی لیتر از تمامی رقت ها در 3 تکرار برروی محیط نوترینت آگار تلقیح شدند. از 4 نمونه خاک، 27 جدایه که از نظر شکل و رنگ و حاشیه کلنی تفاوت بیشتری با بقیه داشتند انتخاب شدند که هر یک پس از کشت مجدد روی همان محیط، خالص شده و در لوله آزمایش حاوی محیط کشت شیبدار در دستگاه انکوباتور نگهداری شدند.
جدول-1برخی خصوصیات جدایه های انتخابی
آزمون میزان تحمل به شوری
به منظور تعیین تحمل جدایه ها به شوری از محیط کشت نوترینت آگار با غلظت های متفاوت نمک - 100،200،400، - 600 شامل مخلوطی از کلرید های سدیم، کلسیم، منیزیماستفاده شد. برای هر جدایه 3 تکرار در نظر گرفته شد. ظروف پتری درون انکوباتور با دمای 28 درجه سانتی گراد نگهداری شد و تغییرات قطر، حالت و ظاهر کلنی ها پس از 24 ساعت مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. سرعت نسبی رشد با مشاهده کیفی کلنی جدایه ها و مقایسه میزان افزایش قطر کلنی هر کلنی ثبت شد.
قرائت دانسیته نوری
به منظور اندازه گیری رشد باکتری ها در محیط مایع - دانسیته نوری - از محیط کشت نوترینت بروس استفاده شد. برای هر جدایه باکتری 3 تکرار - با غلظت 600 مولار نمک - و 1 نمونه شاهد - بدون نمک - در نظر گرفته شد. میزان رشد باکتری ها - دانسیته نوری - با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر با طول موج 600 اندازه گیری شد.
رنگ امیزی گرم
به منظورانجام رنگ امیزی گرم، گسترده میکروبی را تهیه و پس از خشک شدن به کمک حرارت تثبیت شد. نمونه به مدت 30 ثانیه با کریستال ویوله رنگ شدو سپس نمونه با آب شسته شد. لایه میکروبی را با لوگول به مدت 30 ثانیه پوشانده و سپس نمونه با آب شسته شد. نمونه ها به وسیله رنگ بر 10تا20 ثانیه بی رنگ شد و سپس نمونه با آب شسته شد. در نهایت نمونه با فوشین به مدت 30 ثانیه رنگ و سپس با آب شسته و خشک شدند. تجزیه آماری با نرم افزار SAS، مقایسه میانگین با آزمون دانکن و رسم نمودار با نرم افزار Excel انجام گردید.
نتایج و بحث
پس از تعیین میزان تحمل باکتری ها به شوری، از شوری با غلظت 600 مولار نمک، 19 جدایه که دارای قطر کلنی و رشد بیشتری بودند انتخاب و سپس به منظور اندازه گیری میزان رشد باکتری ها در محیط مایع دانسیته نوری باکتری ها اندازه گیری شد. نتایج حاصل از جدول - 2 - نشان داد که میزان رشد - دانسیته نوری - جدایه های مختلف باکتری در سطح 0/1 درصد معنی دار بوده است.
