بخشی از مقاله
چکیده
آلودگی های خاک با فلزات سنگین در دهه های اخیر به یک فاجعه جهانی تبدیل گردیده است که ناشی از فعالیت های انسانی می باشد. سرب گسترده ترین عنصر سنگین در محیط زیست می باشد .تشخیص سویه های مقاوم به این فلز سمی، اولین گام در به کار گیری آن ها در فرایند پاکسازی زیستی است. در این مطالعه ، 4 نمونه از خاک های اطراف کارخانه مس سرچشمه برداشت شد و بعد از جداسازی وکشت ، بوسیله تست های متداول بیوشیمیایی شناسایی گردیدند.تست مقاومت نیز جهت بدست آوردن حداقل غلظتی از سرب که مانع رشد باکتری ها می گردد، صورت گرفت. باتوجه به نتایج به دست آمده از بین سویههای جداشده سویه K5 دارای بیشترین مقاومت در غلظت بالای سرب و بیشترین میزان تولید سیدروفور می باشد این سویه توانایی تولید سیانید هیدروژن را نیز دارا بود.
واژ های کلیدی: سرب، جداسازی باکتری، سویه مقاوم، غنی سازی ،نوترینت آگار
مقدمه
در دهه های اخیر مسئله آلودگی خاک با فلزات سنگین در بیشتر کشورها به یک موضوع جدی تبدیل شده است و آلودگی های زیست محیطی با فلزات سنگین به ویژه آلودگی های خاک یک فاجعه جهانی محسوب می شوند - Saba, et al. 2015 - فلزات سنگین به طور طبیعی به عناصری که وزن اتمی بالا و چگالی حداقل 5 برابر بیشتر از آب دارند گفته میشود . - Tchounwou , et al. 2012 - که یک گروه خطرناک شیمیایی را تشکیل میدهند و با انتشار به داخل محیط زیست خطرات بزرگی برای سلامت انسان دارند . - Akpor and Muchie 2010 - این گروه عمدتا شامل: سرب - Pb - ، آرسنیک - As - ، روی - Zn - ، کادمیم - Cd - ، مس - Cu - ، جیوه - Hg - و نیکل - Ni - میباشند . - Raymond and Felix 2011 -
که در این بین سرب یکی از معمول ترین آلوده کننده ها در طبیعت محسوب می شود و در بین گسترده ترین، پایدارترین و سمی ترین آلاینده های خاک قرار دارد - Gupta DK , et al. 2013 - سطوح بالای سرب در خاک نتیجه استفاده از رنگ های سربی، گلوله های ساخته شده از سرب، استفاده از آفت کش های آرسنات - Muhammad Sajidl, et al. 2011 - \ و سرب، سوخت زغال سنگ، بنزین، مواد محترقه، دفن فاضلاب شهری غنی از سرب مانند باتری سرب می باشد. نگرانی های زیادی در مورد اثرات مضرسرب بر روی سلامت انسان در اثر مصرف و جذب مواد حاوی سرب وجود دارد، از جمله مصرف مستقیم خاک آلوده و ورود سرب به داخل زنجیره غذایی از طریق گیاهان می تواند خطر زیادی برای سلامت انسان داشته باشد - Jarup 2003 - - Hassan, et al. .2008 - .
قرار گرفتن در معرض سرب برای کوتاه مدت می تواند باعث آسیب های کلیه، مغز و همچنین ناراحتی دستگاه گوارش در انسان شود، در حالیکه قرار گرفتن در معرض سرب برای طولانی مدت می تواند اثراتی بر روی سیستم عصب مرکزی، خون، کبد و سیستم تولید مثل داشته باشد. با توجه به اینکه این سنگین به راحتی تجزیه نمیشوند و در محیطماندگاراست، اصلاح و حذف آن از محیط آلوده یک فرایند مهم و ضروری محسوب می گرددGhnaya and Ben Rejeb , et al. 2010a - - Zaier , Ghnaya and Lakhdar, et al. 2010 b - امروزه جهت پاکسازی و اصلاح خاک، آب و هوای آلوده از فلزات سنگین فناوری گیاهپالایی1 به کار گرفته میشود . - Pulford and Watson 2003 -
که برای انجام اصلاح عملی و موثرتر این فرایند، خاک و گیاهان با باکتریهای ریزوسفریمحرک رشد گیاه2 تلقیح میگردند - . - Huang, et al. 2005 از مهمترین فاکتورهای محدود کننده کاربرد باکتریهای ریزوسفری محرک رشد در تکنیک گیاهپالایی مقاومت و پایداری کم این باکتریها به غلظتهای مختلف فلزات سنگین می باشد. اما در برخی از مطالعات وجود ریز موجودات مقاوم به فلزات سنگین در خاکهای آلوده گزارش شده است - Idris, et al. 2004, .Sessitsch, et al. 2013 - با توجه به موارد ذکر شده جداسازی باکتریهای محرک رشد مقاوم به فلز سنگین یک امر ضروری جهت افزایش کارایی گیاهپالایی میباشد. بنابراین در این مطالعه به جداسازی جدایههای مقاوم به سرب در خاکهای اطراف کارخانه مس سرچشمه و بررسی حداقل غلظت بازدارنده سرب می پردازیم.
مواد و روش ها
6 سویه باکتری مقاوم به سرب از طریق غنیسازی اولیه جداسازی گردید و در محیط کشت جامد حاوی نوترینت اگار و نیترات سرب کشت داده شد. به منظور به دست آوردن حداقل غلظت بازدارنده - MIC3 - از هر کلونی خالص باکتریایی به محیط کشت مایع SLP به ترتیب با سری غلظتهای صفر 50، 100، 200، 400 و800 میلیگرم درلیتر نیترات سرب انتقال داده شد و پس از آن که به مدت پنج روز محیطهای مایع در دمای 28 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه، تکان داده شدند. حداقل غلظت سرب بازدارنده رشد باکتری بر اساس ایجاد کدورت در محیط مایع مشخص شد . - Shirdam et al., 2006 - اندازهگیری توان تولید سیانید هیدروژن تعیین توان تولید سیانید هیدروژن بر اساس روش دونیت کوریا انجام شد . - Donate-Correa, et al. 2004 -
برای این منظور، ابتدا جدایهها در محیطهای نوترینت آگار غنی شده با گلایسین 4/4 - گرم در لیتر - کشت داده شدند. به این ترتیب که هر پلیت با 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری که به مدت 48 ساعت در انکوباتور نگهداری شده بودند، تلقیح گردید. سپس یک کاغذ صافی آغشته به محلول معرف شامل کربنات سدیم دو درصد و اسیدپیکریک 0/5 درصد در داخل درب پلیت قرار داده شد. سپس پلیتها با استفاده از پارافیلم درزبندی شدند، تا از خروج گاز سیانید هیدروژن جلوگیری شود. آنگاه پنج روز در انکوباتور در دمای 28 درجه سلسیوس، نگهداری و بر اساس تغییر رنگ کاغذ صافی از رنگ زرد اولیه - عدم تولید - به کرم - کم - ، نارنجی - متوسط - ، قهوهای روشن - نسبتا زیاد - و آجری - زیاد - که به ترتیب از یک تا پنج درجهبندی شدند، میزان تولید سیانید هیدروژن تعیین شد.
اندازهگیری میزان تولید سیدروفور به روش نیمه کمی :CAS
این آزمون با استفاده از روش اصلاح شده الکساندر و زوبرر انجام شد . - Alexander and Zuberer 1991 - برای تهیه این محیط، چهار محلول شامل معرف Fe-CAS ، بافر، محلول غذایی و کازآمینواسید با هم مخلوط شد. ابتدا باکتریها در محیط کشت نوترینت براس به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. سپس 15 میکرولیتر تعلیق تازه باکتری به روش لکهگذاری روی پلیتهای حاوی محیط CAS کشت داده شد. پلیت های تلقیح داده شده به مدت پنج روز در دمای 30 درجه در انکوباتور نگهداری شدند. تولید هاله نارنجی رنگ در اطراف کلونی، بیانگر توانایی تولید سیدروفور بود. پس از پنج روز، قطر هاله و نسبت قطر هاله به قطر کلونی اندازهگیری شد.
نتایج و بحث
با توجه به جدول - 1-1 - سه جدایهی K1، K2 و K3 در غلظت 50 میلیگرم در لیتر و جدایه K6 در غلظت 100 میلی-گرم در لیتر و جدایههای K4 در غلظت 200 میلیگرم در لیتر و K5 در غلظت 800 میلی گرم در لیتر سرب رشد کردند و از خود مقاومت نشان دادند. جدایه K5 مقاومترین جدایه مورد مطالعه نسبت به غلظت سرب بود. در بین 6 سویه جداشده تنها جدایه K5 توانایی تولید سیانید هیدروژن را با درجه 4 - نسبتا زیاد - دارا بود و دیگر جدایهها توانایی تولید سیانید هیدروژن را نداشتند. در یک تحقیق تنها یک جدایه از جدایههای ریزوسفری مطالعه شده در یک منطقه نیمه خشک توانایی تولید HCN را دارا بود - Bhatt and Rajiv Manuel Vyas 2014 - برخی مطالعات اخیر بر این باورند که برخی گونههای سودوموناس به دلیل ترشح سانید هیدروژن باعث افزایش استقرار بوته شده اند. سویههای متعلق به جنس باسیلوس و سودوموناس جدا شده از خاک ریزوسفری خردل هندی HCN تولید میکنند و کاربرد آفتکشها هیچ تأثیر معنیداری بر تولید HCN توسط این سویهها نداشته است . - Saharan and Nehra 2011 -
نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که بجز جدایهی K6 که توانایی تولید سیدروفور را در محیط CAS نداشت، جدایه-های K1، K2، K3 و K4 همگی دارای نسبت هاله به کلونی یک بودند و سویهی K5 بیشترین میزان تولید سیدروفور با نسبت هاله به کلونی 1/56 را به خود اختصاص داد. سویه K5 تفاوت معنیداری با دیگر سویههای تولید کننده سیدروفور داشت - شکل . - 1-1 حجتنوقی و همکاران - - 1392، گزارش کردند که %48 جدایههای ریزوسفری مورد آزمایش قادر به تولید سیدروفور در محیط جامد CAS بودند. همچنین سرچشمهپور و همکاران - 1388 - اظهار داشتند %46 جدایههای مورد بررسی توانایی تولید سیدروفور را درارا بودند. در سال Singh 2015 و همکاران گزارش کردند که نسبت هاله به کلونی تولید سیدروفور در دو جدایه مورد بررسی قرار گرفته به ترتیب 0/43 و 0/25بود . - Singh, et al. 2015 - طبق یک گزارش توسط بت و همکاران در سال 2014، %40 جدایهایِ که از خاک ریزوسفری گیاهان در حال رشد در منطقهای نیمهخشک، جدا شده بودند، توانایی تولید سیدروفور را دارا بودند . - Bhatt and Rajiv Manuel Vyas 2014 -
