بخشی از مقاله
مقدمه
از گذشتههاي دور قارچها داراي ارزش دارویی و خوراکی براي بشر بودهاند. با عمومیت یافتن کشت و پرورش قارچ تولید جهانی آن افزایش یافته است. تولید قارچ میتواند مقادیر عظیمی از مواد زائد لیگنوسلولزي را به طیف گستردهاي از محصولات (دارویی، خوراکی و کود) تبدیل کند و همچنین از محیط زیست محافظت نماید .(1) قارچ خوراکی دکمهاي سفید با سایر قارچهاي خوراکی مورد کشت، از نظر تغذیهاي و درمانی تفاوت چندانی ندارد، اما آنچه که این قارچ را کاملاً متمایز از سایر قارچها ساخته است، گسترش جهانی تولید این قارچ است، به طوري که این قارچ در تمامی سوپرمارکتهاي جهان فروش زیادي
26
دارد .(5) افزایش عملکرد قارچ خوراکی دکمهاي سفید وابستگی مستقیم با کیفیت کمپوست دارد. براي پژوهشگرانی که راجعبه کمپوست تحقیق میکنند تعیین تنوع و ساختار جمعیت میکروبی درگیر در فرآیند کمپوستسازي بسیار مهم است. جمعیت میکروبی کمپوست نقش اساسی در تولید کمپوست با کیفیت مطلوب دارد .(17)
آکتینومیستها به ویژه گونههاي گرمادوست مهم ترین اجزاي جمعیت میکروبی کمپوست هستند که به عنوان تجزیهکننده مواد سلولزي از نظر کشاورزي، بسیار حائز
L-Tyrosine
K2HPO4
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
اهمیت میباشند. این باکتریها منابع مهم تولید آنتیبیوتیکها به شمار میروند(.(4
آکتینومیستهاي گرمادوست هوازي و غیر اسید فست هستند. این موجودات گرم مثبت و داراي فیلامنتهاي شاخهدار بوده و در دیواره سلولی آنها میکولیک اسید وجود ندارد .(10) این گروه بیشتر بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی از جمله تولید میسلیوم هوایی و رویشی طبقهبندي شدهاند. جنسهاي مختلفی در این گروه از آکتینومیستها وجود دارند .(21)
جنس Streptomyces یکی از مهم ترین آکتینومیستهاي گرمادوست است. گونههاي این جنس توانایی تجزیه بسیاري از ماکرومولکولهاي مختلف مانند ترکیبات سلولزي، نشاسته، لیپید و کیتین را دارا میباشند. نژادهاي متفاوتی از آنها براي توانایی تجزیه سلولز مورد مطالعه قرار گرفتهاند. نژادهاي Streptomyces مقادیر زیادي پروتئینهاي خارجسلولی از جمله سلولاز ترشح میکنند .(13)
سلولازها کمپلکسی آنزیمی از سه گروه می باشند که بطور همافزایی با یکدیگر عمل میکنند و میتوانند پیوندهاي گلوکوزیدي β(1- 4) را هیدرولیز نمایند. این آنزیم از بتا
1و-4 اندوگلوکاناز، سلوبیوهیدرولاز و بتا گلوکوزیداز تشکیل شده است .(20)
در مطالعه اي که توسط جانگ و چن در سال 2003 انجام شد، جدایهاي از جنس Streptomyces با توانایی تولید سلولاز مقاوم به حرارت معرفی شد .(13) محققان دیگري نیز گونههاي S. lividens ، S.albaduncus ،S.reticuli را گزارش کردهاند که در شرایط بهینه و استفاده از پودر سلولز به عنوان منبع کربن داراي تولید آنزیم اندوگلوکاناز قابل توجهی بودند .(6)
ترکیب جمعیت میکروبی کمپوست قارچ خوراکی در فاز دوم یکی از مهم ترین عوامل مؤثر در میزان عملکرد قارچ خوراکی است. شناسایی آکتینومیستهاي داراي قدرت تجزیه سلولز میتواند جهت دستورزي ترکیب کمپوست
استفاده گردد و عملکرد قارچ در واحد سطح را افزایش دهد. هدف از این مطالعه بررسی تنوع این باکتریها و تعیین فعالیت سلولازي آنها به روش اندازه گیري سلولاز کل با سوبستراي کاغذ واتمن شماره 1 بود. این جدایهها براي تلقیح روي کمپوست قارچ خوراکی جهت بهبود کیفیت آن به کار برده شدند.
مواد و روشها
جداسازي باکتریها: نمونههاي کمپوست مورد استفاده در این تحقیق، از مرکز تحقیقات قارچهاي خوراکی دانشکده کشاورزي دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شد. نمونهبرداري از مراحل مختلف فاز دوم کمپوستسازي انجام شد.
نمونهها توسط تکنیک رقیقسازي در محیط کشت کمپوست آگار غنی شده با محیط CYM (ترکیبات CYM
1 Peptone :(5X) گرم، 0/24 گرم،
0/5KH2PO4 گرم، 1 Yeast Extract گرم، 10 Dextrose
گرم و 0/5 MgSO47H2O گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر) در دماي 40 درجه سانتی گراد تا ظاهر شدن کلنی باکتریها قرار داده شدند. کلنیهاي با ظاهر گچی و خشبی به محیط جدید منتقل شده و کشتهاي خالص از هر کدام از جدایهها تهیه شد.
آزمونهاي بیوشیمیایی: آزمونهاي احیاينیترات، کاتالاز، هیدرولیز اوره، اسیدفست جزئی و رنگ آمیزي گرم روي جدایهها انجام شد. باکتریها براي بررسی ظاهر کلنی و اندام هوایی روي محیط کشت آب-آگار کشت شدند. توانایی تولید ملانین با استفاده از محیط کشت ] ISP7ترکیبات
15 Glycerol :ISP7 گرم، 0/5 گرم، L-
1 Asparagine گر م، 0/5 K2HPO4 گرم، MgSO47H2O
0/01 گرم، 1 Trace Element HO -LE میلیلیتر (ترکیبات
2/85 H3 BO3 :Element HO-LE گرم، 1/8 MnCl24H2O
گرم، 1/77 Sodium Tartate گرم، 1/36 FeSO47H2O
گرم، 0/04 CoCl26H2O گرم، 0/027 CuCl22H2O گرم،
27
ZnCl2
Na2MoO42H2O
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
0/025 گرم، 0/02 گرم در 1000
میلیلیتر آب مقطر) و 15 Agar گرم در 100 میلیلیتر آب
مقطر[ و تولید رنگیزه در هر کدام از جدایهها با استفاده از محیط کشت ] ISP5 ترکیبات 10 Glycerol :ISP5 گرم، L-
1 Asparagine گرم، 1 K2HPO4 گرم، Trace Salt 1 Soulation میلیلیتر (ترکیبات : Trace Salt Soulation
1 FeSO47H2O گرم، 1/0 MnCl24H2O گرم و
0/1 ZnSO47H2O گرم در 100 میلیلیتر آب مقطر) و 15 Agar گرم در 1000 میلیلیتر[ مورد بررسی قرار گرفت .(18)
شناسایی مولکولی: پس از استخراج DNA از جدایههاي آکتینومیست، با استفاده از پرایمرهاي عمومی ژن
16SrRNA، fD1 (توالی پرایمر رفت 5'- :fD1
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' و rP2 (توالی
پرایمر برگشت 5'- :rP2
(22) (ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' واکنش زنجیرهاي پلیمراز انجام گردید. چرخه حرارتی PCR به صورت مرحله دناتوراسیون اولیه در دماي 96 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه، دناتوراسیون در دماي 96 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه در بقیه چرخهها، مرحله اتصال در دماي 56 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله طویلشدن در دماي 72 درجه سانتی گراد به مدت
2 دقیقه انجام گرفت. مرحله آخر طویل شدن به مدت 5
دقیقه انجام شد. این برنامه در 30 چرخه تکرار گردید. به منظور شناسایی و تعیین تنوع جدایههاي آکتینومیستها، الگوي برشی ژن 16SrRNA براي هر کدام از جدایهها پس از هضم با آنزیمهاي MboI ,KpnI ,PstI ,HindIII ,SalI
از این نتایج آکتینومیستهاي جداسازي شده شناسایی
شدند.
اندازهگیري فعالیت آنزیمی: از محیط کشت تولید آنزیم
سلولاز با ترکیب 1 CMC(Carboxymethylcellulose))
درصد، 0/5 Yeast extract درصد، 0/05 K2HPO4درصد، 0/02 NaClدرصد ،0/02 MgSO47H2Oدرصد، NH4NO3
0/1درصد و 0/002 FeCl3درصد) براي تعیین فعالیت آنزیمی جدایهها استفاده شد. باکتریها در دماي 40 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت در این محیط کشت قرار داده شدند. در تراکم نوري یکسان (OD600nm=1)، محیط کشتها پس از عبور از کاغذ صافی، در 6000 rpm به مدت
15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. عصاره حاصل پس از عبور از فیلتر میلی پور 0/22) میکرومتر) به عنوان منبع آنزیم استفاده گردید. مقدار پروتئین در عصاره آنزیمی ناخالص با روش برادفورد اندازهگیري شد .(7) از عصارههاي آنزیمی به دست آمده از رشد هر جدایه براي توانایی هیدرولیز سوبستراي، فیلتر کاغذي 1×6 سانتیمتري (واتمن شماره
(1 مورد استفاده قرار گرفت. مخلوط سوبسترا با یک میلیلیتر عصاره آنزیمی و یک میلیلیتر بافر فسفات 6/5-9
pH : به مدت 30، 60 و 90 دقیقه در حمام آب گرم با دماهاي 45 تا 65 درجه سانتی گراد نگهداري شد. مقدار قند احیاء کننده آزاد شده با استفاده از روش
(16) DNS (Dinitrosalicylic acid) اندازهگیري شد.
فعالیتهاي آنزیمی به صورت واحد در میلیلیتر عصاره ناخالص آنزیمی گزارش شد .(11)
بحث و نتیجه گیري
,PaeI ,VspI با استفاده از نرم افزار TotalLabTL120 تهیه شد. الگوهاي برشی به دست آمده براي هر جدایه با الگوهاي به دست آمده از هضم توالیهاي معتبر آکتینومیستهاي ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی NCBI که در محیط اینسیلیکو هضم شده بود مقایسه شد. با استفاده
28
نتایج حاصل از آزمونهاي بیوشیمیایی باکتریهاي آکتینومیست جدا شده در جدول 1 آورده شده است. این نتایج منطبق بر خصوصیات آکتینومیستها بود.
نتایج تجزیه و تحلیل مولکولی: براساس نتایج به دست آمده از هضم اینسیلیکوي توالیهاي ژن 16SrRNA با
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
استفاده از آنزیمهاي برشی، آنزیم MboI به عنوان آنزیم از این آنزیم (شکل (1 جدایهها را میتوان به سه گروه
کلیدي در شناسایی آکتینومیستهاي جداسازي شده متمایز دستهبندي کرد (جدول .(2
انتخاب شد .(9) با استفاده از الگوي برشی به دست آمده
جدول-1 مشخصات جدایهها همراه با نتایج تستهاي بیوشیمیایی آنها
شماره محل رنگ اسپور آزمون آزمون آزمون آزمون آزمون ISP5 ISP7
جدایهها جمعآوري گرم اسیدفست کاتالاز اورهآز احیاي
(کمپوست) نیترات
1 فاز 2 سفید + - + + + + +
2 فاز 2 سفید + - + - + + +
3 فاز 2 سفید + - + + + + +
4 فاز 2 خاکستري + - + - + + +
5 فاز 2 سفید + - - + + + +
6 فاز 2 سفید + - + + + + +
7 فاز 2 خاکستري + + + + - + -
8 فاز 2 سفید + - + + + + +
9 فاز 2 سفید + - + + + + +
10 فاز 2 سفید + + + - + + +
11 فاز 2 خاکستري + - + + + + +
12 فاز 2 سفید + -+ + - + + -
13 فاز 2 سفید + + + + + + -
14 فاز 2 خاکستري + - + + + + +
15 فاز 2 سفید + + + + - + -
16 فاز 2 سفید + - + + - + +
17 فاز 2 خاکستري + - + + + + -
18 فاز 2 سفید + - + + - - +
19 فاز 2 سفید + - + + + + -
20 فاز 2 سفید + - + + + + +
21 فاز 2 خاکستري + - + + - + -
22 فاز 2 سفید + + + - + + +
23 فاز 2 سفید + - + - + + +
24 فاز 2 زرد + + + - + + +
جدول-2 تقسیمبندي باکتریها به سه گروه اصلی براساس الگوي برشی آنزیم .MboI
شماره جدایه الگوي برشی با آنزیم MboI
23،22،21،20،19،17،16،15،14،13،12،11،10،9،8،7،6،5،4،3،2،1 بزرگترین قطعه 750> DNA جفت باز (گروه (1
24 دو قطعه مشخص که با هم 980> جفت باز (گروه (2
29
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
18 بزرگترین قطعه DNA برابر با 980 تا 1350 جفت باز
(گروه (3
شکل-1 الگوي برشی جدایهها بر اساس ژن 16SrRNA، توسط آنزیم برشی MboI
