بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم بتاگلوکوزیداز - EC 3.2.21 - با تبدیل سلوبیوز به گلوکز و تکمیل مرحله آخر تبدیل سلولز به گلوکز نقش مهمی درتولید بیواتانول دارد. 101 نمونه جدا شده از خاك جنگلهاي شمال کشور از لحاظ فعالیت بتاگلوکوزیدازي با استفاده از روش تست کنگو رد بصورت کیفی مورد ارزیابی قرار گرفتند. از بین 101 ایزوله تریکودرما، ایزولهT.1 با نسبت قطر هاله به قطرکلنی 1/6 و 2/6 داراي بیشترین شاخص سنجش کیفی فعالیت سلولازي به ترتیب در حضور و عدم حضور گلوکز به عنوان نمونه برتر شناخته شد. این ایزوله در سنجش کمی فعالیت بتاگلوکوزیدازي نیز فعالیت 0/7 U/ml از خود نشان داد که درمقایسه با نمونه صنعتی Trichoderma.reesei حدود 4 برابر بشتر بود. به این ترتیب ایزولهT.1 به عنوان نمونه برتر نسبتبه T.reesei از لحاظ فعالیت بتاگلوکوزیدازي شناخته شد که میتواند در صنعت مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدي: بتاگلوکوزیداز1، بیواتانول، متحمل به گلوکز، Trichoderma reesei
مقدمه
با رشد روز افزون جمعیت و توسعه صنعت، تقاضاي مصرف انژري در سالهاي اخیر به شدت افزایش یافته است. همچنینآثارسوء زیست محیطی ناشی از مصرف سوختهاي فسیلی باعث شده تا محققین به دنبال یافتن منابع انرژي پاك، تجدیدشدنی از جمله انرژي مشتق از بیوماس نظیر لیگنوسلولز باشند. بیوماس لیگنوسلولزي یکی از فراوانترین و ارزانترین منابع براي تهیه بیواتانول به عنوان سوخت پاك میباشد، که از این مقدار تنها حدود 2 درصد توسط انسان مورد استفاده قرار میگیرد. در بین میکروارگانیسمهاي تولید کننده سلولاز، گونههاي قارچ Trichoderma از مهمترین تولید کنندههاي سلولاز محسوب میشوند، بطوریکه میزان ترشح آنزیم درسویههاي مهندسی شده T.reesei بیش از 100 g/l گزارش شده است - . - 3
سیستم سلولازي تریکودرما شامل سه آنزیم اگزوکلوکوناز2، اندوگلوکوناز3 و بتاگلوکوزیداز میباشد که به صورت همافزایی باعث تجزیه سلولز میگردد. بتاگلوکوزیداز با تبدیل سلوبیوز به گلوکز، مرحله آخر هیدرولیز سلولزي را کامل میکند. اما این آنزیم بهعنوان یک محدود کننده سرعت هیدرولیز نیز محسوب میشود چراکه مطالعات زیادي نشان داده است در تریکودرماریسیه، مقدار ترشح آنزیم بتاگلوکوزیداز در حد مطلوب نبوده و همین مقدار کم ترشح شده نیز تا حد زیادي حساس بهغلظت بالاي گلوکز میباشد. نهایتا هر دوي این نقص در آنزیم بتاگلوکوزیداز منجر به تجمع ديساکارید سلوبیوز در محیط میگردد و چون سلوبیوز نیز براي اگزوگلوکناز و اندوگلوکناز به عنوان یک مهارکننده عمل میکند، تجمع این ديساکاریدمنجر به توقف کل سیستم سلولازي این میکروارگانیسم میگردد.
بنابراین ترشح در حد مطلوب این آنزیم و نیز تحمل غلظتبالاي گلوکز ارتباط تنگاتنگی با تولید مقرون به صرفه بیواتانول از طریق هیدرولیز آنزیمی دارد - . - 4 در این مطالعه نیز به منظورانتخاب بهترین ایزوله از لحاظ فعالیت بتاگلوکوزیدازي، طی دو سري غربالگري از بین 101 ایزوله مختلف تریکودرما بهترینایزوله انتخاب و جهت تعیین میزان دقیق از فعالیت بتاگلوکوزیدازي به روش کمی مورد سنجش قرار گرفته و با T.reeseiمقایسه گردید.
مواد و روشها
سویههاي قارچی و مواد
نمونههاي قارچ جدا شده از خاك جنگلهاي شمال ایران از کلکسیون قارچ تریکودرماي موجود در آزمایشگاه بیوتکنولوژي دانشکده کشاورزي دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردید. همچنین نمونه صنعتی T.reesei با کد PTCC 5142از مرکز کلکسیون قارچها و باکتريهاي ایران خریداري شد. همه نمونهها در محیط کشت PDA کشت داده شدند و براي تولید کنیدي در دماي 28℃ انکوبه شدند.غربالگري به روش تست کنگو رد.جهت انتخاب بهترین ایزوله در بین 101 ایزوله از لحاظ تولید سلولاز از تست کنگو رد استفاده گردید - . - 1 براي این منظور از محیط کشت حاوي: - 3 g/l - NaNO3، - 1 g/l - K2HPO4، - 0/5 g/l - MgSO4، - 0/5 g/l - KCl، FeSO4.7H2O - 0/01 mg/l - ، - 0/1 % v/v - Triton X100، آگار - 20 g/l - که داراي کربوکسی متیل سلولز - 1 % w/v - - CMC - 5 به عنوان تنها منبع کربن بود براي غربالگري اولیه جهت انتخاب بیشترین تولید کننده سلولاز - غربالگري اولیه - استفاده شد، و به منظور انتخاب ایزوله با فعالیت بتاگلوکوزیدازي بالا - غربالگري ثانویه - به محیط کشت ذکر شده، گلوکز - 25 % w/v - اضافه گردید. بعد از کشت ایزولهها در این محیط کشت به مدت 96 h در دماي 30 ℃ و سپس 18 h در دماي 45 ℃ انکوبهشدند. بعد از طی این مدت به پلیتها 10 ml از رنگ کنگو رد با غلظت 2 g/l اضافه گردید و به مدت 15 min با سرعت 50 rpm شیک شدند. بعد از آن رنگ کنگو رد حذف شده و به پلیتها NaCl - 1 M - 10 ml اضافه شد و بعد از 10 minشیک شدن در همان سرعت، قطر هاله اطراف کلنیها اندازهگیري شد.
تولید سلولاز
محیط کشت مندل حاوي: - 2 g - KH2 PO4، - 1/4 g - - NH4 - 2 SO4، - 0/3 g - Urea، - 0/3 g - MgSO4.7H2O، - 0/4 g - CaCl2.2H2O، - 5 mg - FeSO4.7H2O، - 1/56 mg - MnSO4.H2O، - 1/4 mg - ZnSO4.7H2O، CoCl2.6H2O - 3/67 mg - ، - 0/8 g - lactose و pH 5 در حجم 1 L جهت تولید سلولاز براي سنجش آنزیمی استفاده گردید - . - 2 بعد ازتلقیح کردن 50 ml از این محیط کشت با 5 ml کنیدي با غلظت /ml - 107کنیدي - ، به مدت 7 روز در دماي 30 ℃ در شیکرانکوباتور با سرعت 200 rpm انکوبه گردید بعد از طی این مدت با سانتریفیوژ محیط کشت با سرعت 4000 rpm به مدت 4 min محلول رویی به عنوان منبع آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت.
سنجش کمی فعالیت بتاگلوکوزیداز
به منظور اندازهگیري کمی فعالیت بتاگلوکوزیداز از pNPG6 به عنوان سوبسترا طبق دستورالعمل ژنگ انجامشد - . - 5 ترکیب نهایی - 3 ml - حاوي 1 ml از محلول - 5 mM - pNPG و 1/8 ml از بافر استات pH 4/8 - ، - 0/1 M و ml0/2 از آنزیم به مدت 30 min در دماي 50 ℃ در حمام آب گرم قرار گرفت. سپس 0/5 ml از سدیم کربنات - 1 M - جهتتوقف واکنش به محلول فوق اضافه گردید. درنهایت میزان جذب نوري pNP7 آزاد شده طول موج 420 nm اندازهگیري شد.
نتایج و بحث
سنجش کیفی فعالیت سلولازي
با استفاده از تست کنگو رد میزان فعالیت سلولازي کلنیها به صورت هاله در اطراف کلنی ظاهر میگردد، به این ترتیب که کلنیها هر میزان از فعالیت بالایی برخوردار باشند قطر هاله نیز بزرگتر میگردد. براین اساس میتوان به صورت کیفی میزان فعالیت سلولازي تعداد زیادي از نمونهها را با هم مقایسه کرد. در این تحقیق تیز بعد از استفاده از این تست، نسبت قطرهاله به قطر کلنی تمام 101 نمونه اندازه گیري شد - شکل - 1 و نمونه T1 با نسبت قطر هاله به قطر کلنی 2/6 به عنوان بهترین نمونه انتخاب گردید. براي ادامه کار 41 ایزوله که داراي شاخص بالاتر از 1/5 بودند به عنوان ایزولههاي بافعالیت سلولازي مطلوب انتخاب شدند و در غربالگري ثانویه استفاده شدند.
در غربالگري ثانویه نیز با توجه به این که گلوکز به عنوان مهار کننده براي آنزیم بتاگلوکوزیداز عمل کرده و باعث کاهش فعالیت کل سلولازي تریکودرما میگرد، ازگلوکز با غلظت 25% - w/v - استفاه شد تا ایزولهاي که هم از لحاظ فعالیت بتاگلوکوزیدازي و هم از لحاظ تحمل غلظت بالاي گلوکزي نسبت به گونههاي دیگر برتري دارد انتخاب شود. به این ترتیب در غربالگري ثانویه، 41 نمونهاي که از لحاظفعالیت سلولازي مطلوب بودند مورد ارزیابی قرار گرفتند که در نهایت مجددا ایزوله T.1 با شاخص 1/6 به عنوان نمونه برترانتخاب شد. - شکل 2و. - 3
