بخشی از مقاله
چکیده
با غربالگري نمونههاي خاك جمعآوري شده از مناطق مختلف ایران، 22 جدایه باکتري حل کننده فسفات بدست آمد. دو جدایه به عنوان P5و P7بزرگترین هاله شفاف را در محیط کشت اسپربر حاوي فسفات نامحلول ایجاد نمودند. جدایه دیگر به عنوان P13 فعالیت فسفاتازي بالایی از خود نشان داد. میزان رشد باکتریایی و فعالیتهاي حلالیت فسفات تحت شرایط محیطی مورد مطالعه قرار گرفت. در مجموع هر سه PSB قادر به مقاومت در برابر افزایش سطح دما، pH و غلظت نمک بالا بودند. باکتريهاي جدا شده به خوبی با ریزسازوارههاي موجود در خاك سازگاري داشتند. در آزمایشهاي گلخانهاي، افزایش جمعیت P13 با ریشه گیاه سیبزمینی همبستگی معنیداري داشت، در صورتی که دو سویه دیگر معنیدار نبود.اثربخشی این باکتريها بر عملکرد سیب زمینی در آزمایشهاي مزرعهاي آماري و مشاهدهاي مورد مطالعه قرار گرفت و افزایش 13 درصدي محصول به طور میانگین مشاهده گشت.
کلمات کلیدي: کود زیستی، باکتري حل کننده فسفات، سیبزمینی
مقدمه
فسفر یکی از مهمترین عناصر غذایی مورد نیاز براي رشد گیاهان میباشد و در تمامی موجودات زنده وجود دارد. گیاهان فسفر را فقط به شکل یونهاي HPO42- و H2PO4- جذب میکنند. تا کنون از کودهاي شیمایی فسفاته براي حل این مشکل استفاده شده است. ولی در عمل درصد بالایی از کودهاي مصرفی با یونهاي خاك ترکیب و به صورت غیرمحلول و غیرقابلجذب در میآیند. باکتريها و قارچهاي حلکننده فسفات قادرند بر روي محیطهاي کشت حاوي فسفات تريکلسیم، آپاتیت یا سایر مواد نامحلول فسفر معدنی با منشاء طبیعی رشد نمایند. چنانچه این ترکیبات را به صورت سوسپانسیون در محیط کشت جامد اضافه کنیم، به راحتی میتوان باکتريهاي حلکننده فسفات را از طریق مشاهدة هاله شفاف ایجاد شده در اطراف کلنی شناسایی کرد. محققین متعددي توانستهاند با استفاده از این روش ریزسازوارههاي حلکننده فسفات را از منابع مختلف جدا نمایند.1 در این تحقیق، باکتريهاي حلکننده فسفات از خاكهاي ایران جدا شده و برخی ویژگیهاي آنها بررسی شده است.
مواد و روشها
تعداد 74 نمونه خاك از مناطق مختلف شامل نمونه خاك مزارع، بیابان، جنگل، باغ، مراتع و غیره جمع آوري شد. به منظور نمونهگیري، از عمق حدود 10 سانتیمتري برداشت شده و در درون ظرف سترون در پوشدار ریخته شد. مقدار یک گرم خاك براي ساخت سریالهاي رقت 10 گانه - تا - 10-10 تهیه شد. از هر رقت مقدار 100 میکرولیتر بر روي محیط کشت اسپربر جامد2 حاوي 2/5 گرم در لیتر تري کلسیم فسفات تلقیح و به طور کامل در سطح پلیت پخش میشد. محیطهاي تلقیح شده یک هفته در دماي 25-28 درجه سانتیگراد نگهداري میشد. بعد از شناسایی کلنیهاي با هاله روشن، از آنها آنقدر کشت مجدد داده میشد تا به صورت خالص جداسازي شوند. براي تعیین قدرتحلکنندگی فسفات باکتريها و مقایسه آنها با یکدیگر، از کشتهاي جوان در نرمال سالین سوسپانسیونی با کدورت معادل یک مک فارلند تهیه شد.
از این سوسپانسیون مقدار 25 میکرولیتر به صورت دایرهاي به قطر نیم سانتیمتر در مرکز محیط اسپربر تلقیح گردید و در دماي 25-28 درجه سانتیگراد در گرمخانه نگهداري گردید. توانایی تولید آنزیم فسفاتاز در حضور فسفات نامحلول و فسفات محلول مورد ارزیابی قرار گرفت. در حالت اول به محیط کشت اسپربر معمولی مقدار 50میکروگرم در میلیلیتر ترکیبBCIP 1 اضافه شد. سپس در زمانهاي 24 ساعت و 48 ساعت و یک هفته از نظر فعالیت آنزیم فسفاتاز مورد بررسی مشاهدهاي قرار گرفت. اثر برخی از عوامل محیطی بر روي این باکتريها بررسی شد. براي این منظور در یک سري آزمایشهاي کمی و کیفی اثر شرایط مختلف دما 30 - ، 35، 40 و 45 درجه سانتیگراد - ، NaCl و 5 - pH، 6، 7 و 8 و - 9 مورد بررسی قرار گرفت. از این باکتريها براي تعیین میزان تثزبخشی در آزمایشهاي مزرعهاي متعددي و در سطح مزارع کشور استفاده شد.
نتایج و بحث
جداسازي باکتريهاي حلکننده فسفات
74 نمونه خاك از نظر پروفیل باکتریایی که قادر به محلول سازي ترکیبات فسفره باشند، مورد بررسی قرار گرفتند. از این خاكها مجموعاً تعداد 22 سویه باکتري جدا شد که خاصیت حل کنندگی فسفات داشتند و در غربالگري اولیه داراي هاله روشن ناشی از حل کردن فسفات نامحلول بودند. با توجه به اینکه قطر هاله ایجاد شده در سویههاي مختلف، متفاوت بود، لذا با یک روش استاندارد قطر هاله شفاف حاصل از حلکنندگی فسفات در 22 سویه جدا شده به صورت مقایسهاي مورد بررسی قرار گرفت. در بین باکتريها، سویههاي P5 و P7 وسیعترین هاله شفاف را تولید میکردند.
بررسی فعالیت آنزیم فسفاتاز باکتريهادر این تحقیق از سوبستراي مصنوعی BCIP استفاده شد.این سوبسترا قبل از هیدرولیز شفاف میباشد. لکن پس از فعالیت آنزیمی و هیدرولیز آن بنیان برموکلروایندولیل که به رنگ آبی میباشد از گروه فسفات جدا میشود. تیرگی رنگ آبی میتواند به عنوان شاخصی از میزان فعالیت فسفاتازي باشد در بین باکتريهاي مورد آزمایش، باکتري P13 بیشترین فعالیت فسفاتازي را نشان میداد که هم در محیط کشت واجد فسفات محلول و هم در محیط کشت واجد تريکلسیم فسفات به خوبی مشهود بود.
تاثیر شرایط مختلف محیطی
بررسیها در کشت جامد و مایع نشان داد، سه باکتري مذکور داراي توانایی بقا در شرایط دمایی تا 45°C و 3 pH تا 11 وغلظتهاي مختلف نمک NaCl تا 5 درصد می باشند. در شرایط سخت مانند دماي 45°C رشد باکتريها متوقف میشود ولی نمیمیرند. توانایی حلکنندگی فسفات نیز تابعی از شرایط محیطی بود، گرچه در کلیه شرایط این فعالیت کمابیش حفظ میگردید. باکتري هاي جدا شده به خوبی با ریزسازواره هاي موجود در خاك سازگاري داشتند.بررسی اثر بخشی باکتريهاي حلکننده فسفات بر رشد گیاه سیبزمینینتایج حاصل از نمونه برداري از خاك گلدانهاي حاوي سویه هاي P5، P7 و P13 نشاندهنده افزایش جمعیت هر سه باکتري درمنطقه ریزوسفر میباشد که درسویه P13 درp<0/01 معنیدار بود و نشاندهنده همبستگی نزدیک باکتريP13بهطور معنیدار با ریشه گیاه سیبزمینی میباشد.
آزمایش هاي مزرعه اي نیز حاکی از اثربخشی این باکتري ها بود.همجنین گزارشهاي جمع آوري شده از 77 مزرعه واجد قسمتهاي شاهد و تیمار از 11 استان حاکی از این است که مصرف این باکتريها - کود زیستی بارور- - 2 به طور میانگین باعث 13 درصد افزایش محصول شده است - جدول . - 1
