بخشی از مقاله
چکیده :
استافیلوکوکوس اورئوس یکی از رایجترین عوامل شیوع مسمومیتهاي غذایی باکتریایی است که به عنوان دومین و یا گاهی سومین علت مهم این بیماريها محسوب میگردد . هدف از این مطالعه بررسی میزان فراوانی ژنهاي کد کننده انتروتوکسینهاي استافیلوکوکوسی SEA و SEC در استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت جدا شده از نمونه هاي شیر خام مخازن تحویلی به کارخانه شیر پاستوریزه مشهد، در طی سالهاي 1388 و 1389 می باشد. از 250 نمونه شیر خام مورد بررسی تعداد 46 سویه - %18/4 - استافیلوکوکوس اورئوس کوآگولاز مثبت با میانگین cfu/ml 3/5 × 105 جدا گردید.
از مجموع 46 سویه جداشده، تعداد 28 سویه 60/87 - درصد - داراي حداقل یک ژن کد کننده انتروتوکسین A یا C بودند. از این تعداد، 21 سویه - %75 - واجد ژن sec و 7 سویه - %25 - واجد ژن sea بودند. همچنین 3 سویه 9/09 - درصد - هر دو ژن sea و sec را به همراه هم داشتند. با توجه به حضور استافیلوکوکوسهاي انتروتوکسیژنیک در شیر خام به عنوان یک خطر بالقوه براي سلامت مصرفکننده، تشخیص آنها و کنترل منابع آلودگی شیر باید به عنوان بخشی از استانداردهاي کنترل کیفی شیر و فراوردههاي لبنی قرار گیرد.
مقدمه.
بیماريهاي ناشی از مواد غذایی اثر مهمی بر سلامت عمومی دارند. بر طبق آمار بدست آمده تنها در آمریکا این دسته از بیماريها در سال 6 تا 80 میلیون نفر را درگیر نموده و موجب مرگ 9000 نفر میگردد و هزینه اي برابر با 5 میلیارد دلار آمریکا در پی دارد
استافیلوکوکوس اورئوس یکی از رایجترین عوامل شیوع مسمومیتهاي غذایی باکتریایی است که به عنوان دومین و یا گاهی سومین علت مهم این بیماريها محسوب میگردد. مسمومیت غذایی این باکتري به علت حضور سویههاي انتروتوکسیژنیک آن در غذاها و هضم آن ایجاد میشود. این باکتري انتروتوکسینهاي متفاوتی تولید میکند.
جدایههایی که ژن sea تا see را دارند و تولید انتروتوکسینهاي کلاسیک A - تا - E میکنند، مسئول 95 درصد مسمومیتهاي غذایی استافیلوکوکوسی هستند. بنابراین حضور استافیلوکوکوس اورئوس در غذا میتواند به عنوان یک خطر بالقوه سلامت باشد
انتروتوکسینهاي استافیلوکوکوس اورئوس بسیار پایدارند و به حرارت پاستوریزاسیون و بسیاري از آنزیمهاي پروتئولیتیک مقاومند و میتوانند در غذاها براي مدت طولانی فعال بمانند
تاکنون 23 انتروتوکسین مختلف شناسایی شده که از نظر ساختاري و توالی مشابه یکدیگر میباشند. تمام این انتروتوکسینها فعالیت سوپرآنتیژنیک دارند درحالی که ثابت شده که فقط تعدادي از آنها SEA - تا SEI ،SER ، SES و - SET سبب استفراغ میگردند. 95 درصد موارد مسمومیتها به وسیله انتروتوکسینهاي کلاسیک A - ، B، C، D و - E رخ میدهد
مقدار انتروتوکسین مورد نیاز براي ایجاد علایم مسمومیت غذایی بسیار کم است و میتواند علایمی چون کرامپ شکمی، تهوع، استفراغ و گاهی اسهال ایجاد کند.
بنابراین روشهاي حساس براي تشخیص انتروتوکسینهاي استافیلوکوکوسی حتی در مقادیر کم مورد نیاز است
روشهاي زیادي جهت تایید حضور انتروتوکسینها بصورت مستقیم در غذا وجود دارد که امکان تشخیص مقادیر در حد نانوگرم انتروتوکسین در یک گرم یا یک میلیلیتر ماده غذایی را دارند. در این روشها انتروتوکسینها، بدون شناسایی معمول باکتري نیز قابل تشخیص هستند. PCR میتواند حضور سویههاي بالقوه انتروتوکسیژنیک استافیلوکوکوس اورئوس را صرف نظر از اینکه این سویهها تولید توکسین میکنند یا خیر بر اساس توالی ژنی مشخص، معین کند
هدف از این تحقیق جداسازي باکتري استافیلوکوکوس اورئوس از نمونههاي شیر خام مخازن تحویلی به کارخانه شیر پاستوریزه مشهد و شناسایی سویههاي واجد ژنهاي کدکننده انتروتوکسین نوع A و C به روش PCR میباشد.
مواد و روش کار.
در طی سالهاي 1388 و 1389، تعداد 250 نمونه شیر خام مخازن تحویلی به کارخانه شیر پاستوریزه در مشهد، جمعآوري گردید. به منظور جستجو و شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت، از پرگنههاي رشد یافته بر روي محیط آگار برد پارکر، به رنگ سیاه با لبه نازك و هاله شفاف مشکوك به استافیلوکوکوس اورئوس برداشته و روي محیط آگار خون دار کشت داده شد. پس از گرمخانه گذاري پرگنههاي رشد کرده از نظر ویژگیهاي ظاهري و همولیز در این محیط کشت مورد ارزیابی قرار گرفت.
جدایههاي مشکوك به استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از رنگ آمیزي گرم و سایر آزمایشهاي بیوشیمیایی نظیرکاتالاز، کواگولاز، DNAآز،VP، مانیتول سالت آگار و غیره تشخیص داده شد و سپس خالص سازي گردید و به محیط کشت BHI جهت انجام سایر آزمایشها منتقل گردید. جدایههاي خالص شده در دماي 4 درجه سانتیگراد نگهداري شدند.
در این مطالعه از سویه استاندارد S. aureus - ATCC 25923 - به عنوان کنترل کیفیت استفاده گردید. در این مطالعه جهت استخراج DNA از کیت تجاري Diatom DNA Prep 100 و دستورالعمل مربوط به آن استفاده گردید و با استفاده از کیت AccuPowerTM PCR PreMix - Bioneer, Korea - ، به کمک آغاز گرهاي femA ، SEA ، SEC به روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. در مورد هر یک از آغاز گرهاي فوق برنامه حرارتی بهینه سازي گردید و به کمک ترمال سایکلر PCR - Techne, England - گردیدند. محصول PCR بر روي ژل آگارز 1/2 درصد الکتروفورز گردید.
نتایج وبحث.
استافیلوکوکوس اورئوس یکی از رایجترین عوامل شیوع مسمومیتهاي غذایی باکتریایی است که به عنوان دومین و یا گاهی سومین علت مهم این بیماريها محسوب میگردد. این باکتري یک پاتوژن فوقالعاده فراگیرنده است و میتواند موجب طیف وسیعی از عفونتهاي ملایم تا شدید و کشنده شود 1 - ، 3، . - 16 این باکتري همچنین شایعترین پاتوژن عامل ورم پستان در گاو است که به طور مرتب در تانک ذخیره شیر یافت میشود، زیرا منبع اصلی آلودگی میکروبی شیر خام، پستان آلوده است
از مجموع 250 نمونه اخذ شده تعداد 92 نمونه 36/8 - درصد - به انواع استافیلوکوکوس و 46 نمونه 18/4 - درصد - به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده بودند. میانگین آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت در نمونهها ×105 cfu/ml 3/5 بود. کلیه سویههاي استافیلوکوکوس اورئوس جدا شده - %100 - به روش آزمایشگاهی، واجد ژن femA بودند
مطالعات قبلی نتایج متفاوتی در مورد میزان شیوع استافیلوکوکوسها و استافیلوکوکوس اورئوس، در مواد غذایی نشان میدهند. این تفاوتها میتواند ناشی از تفاوت در مواد غذایی آزمایش شده، تعداد نمونهها، روش جستجوي ارگانیسم، میزان رعایت بهداشت در منطقه مورد مطالعه و یا عوامل دیگر باشد. به طور مشابه میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس در شیر گاو نیز در مقادیر متفاوتی گزارش شده است. در مطالعه ادوان و همکاران - 2005 - میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در 250 نمونه شیر خام گاو و گوسفندان سالم جمعآورري شده در فلسطین معادل 100 نمونه 40 - درصد - بوده است
فاگوندس و همکاران - 2010 - این باکتري را از 10/8 درصد نمونههاي شیر تانک ذخیره جدا نمودند . - 7 - سلطان دلال و همکاران - 2010 - میزان آلودگی به این باکتري را در فراوردههاي لبنی 17/1 درصد گزارش کردند . - 14 - بارتلومئولی و همکاران - 2009 - استافیلوکوکوس اورئوس را از 83 درصد نمونههاي شیر خام جدا نمودند . - 4 - تفاوتهاي منطقهاي در شیوع استافیلوکوکوس اورئوس مشاهده شده در نمونههاي تانک ذخیره در مطالعات مختلف، می تواند ناشی از تفاوت در وضعیت آب و هوا و بهداشت و مدیریت گاوداري باشد.
100 درصد نمونهها داراي ژن femA بودند . بعبارت دیگر حضور ژن femA در سویههاي تایید شده با روشهاي معمول آزمایشگاهی100 درصد بود، که این نتیجه با نتایج مطالعات دیگر مطابقت دارد. پلیسر و همکاران - 2009 - ژن femA - اختصاصی براي استافیلوکوکوس اورئوس - را در 91 سویه از 102 سویه استافیلوکوکوس کواگولاز مثبت جداشده از پنیر و فراوردههاي گوشتی شناسایی کردند
بررسی حضور ژنهاي کد کننده انتروتوکسین A و C در جدایههاي استافیلوکوکوس اورئوس جداسازي شده، به وسیله PCR، نشان داد تعداد 28 سویه 60/87 - درصد - از باکتري مورد مطالعه داراي حداقل یک ژن کد کننده انتروتوکسین A یا C بودند. از این تعداد، 21 سویه - %75 - واجد ژن sec و 7 سویه - %25 - واجد ژن sea بودند. همچنین 3 سویه 9/09 - درصد - هر دو ژن sea و sec را به همراه هم داشتند. - تصویر. - 1 بر این اساس بیشترین ژن انتروتوکسین ردیابی شده sec و بعد از آن sea میباشد. با استفاده از روش PCR میتوان حضور سویههاي بالقوه انتروتوکسیژنیک استافیلوکوکوس اورئوس را صرف نظر از اینکه این سویهها تولید توکسین میکنند یا خیر، بر اساس توالی ژنی مشخص، معین کرد
در مطالعه حاضر به روش PCR مشخص گردید 71/74 درصد باکتريهاي مورد مطالعه داراي حداقل یک ژن انتروتوکسین میباشند که این میزان با بسیاري از مطالعات قبلی مطابقت دارد. مشاهده شده که نسبت بالایی از سویههاي حیوانی، تولید SEC و سویههاي انسانی بیشتر تولید SEA میکنند . - 9 - چندین بررسی انجام شده نشان داده که هیچ یک از سویههاي جدا شده از شیر گاو و بز مورد بررسی، ژن seb نداشتند
در مقالات مختلف انتروتوکسین A عموما به عنوان عمده انتروتوکسین مسئول در مسمومیتهاي غذایی استافیلوکوکوسی معرفی شده است که عمدتا توسط بیوتیپهاي انسانی استافیلوکوکوس اورئوس تولید میشود. همچنین انتروتوکسین C بیشترین سهم انتروتوکسینهاي تولیدي را از بیوتیپهاي گاوي این باکتري به خود اختصاص میدهد 10 - ،. - 9 پس با قبول این نکته که عمده آلودگی استافیلوکوکوسی شیر خام ناشی از انتقال آلودگی از دام به شیر و یا انتقال آلودگی از دست کارگران در حین جمعآوري و فرآوري آن میباشد، نتایج به دست آمده در مطالعه حاضر، به طور کامل قابل توجیه خواهد بود. چنان که در بسیاري از مطالعات مشابه نیز نتایجی مشابه به دست آمده است.
در مطالعه اشراقی و همکاران - 1388 - به منظور بررسی توزیع فراوانی ژن tst با ژنهاي entC، entA وentA/C در جدایههاي استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از مواد غذایی در مجموع 100 سویه 9/5 - درصد - استافیلوکوکوس اورئوس از نمونههاي غذایی جدا گردید که 25 درصد جدایه ها حامل ژن entC و 8 درصد جدایه ها حامل entA، بودند. همچنین 9 درصد استافیلوکوکوس اورئوس حامل ژن هاي entA+C بودند
در مطالعه رودریجوس دا سیلوا و همکاران - 2005 - در بررسی حضور ژنهاي انتروتوکسین A، B و C ، در 37 درصد سویههاي جدا شده موارد ورم پستانی در گاو و بز در گلههاي شیري برزیل، ژن انتروتوکسین ردیابی گردید. در بین سویههاي جدا شده از نمونههاي مربوط به گاو، 6/3 درصد همزمان ژن انتروتوکسین sea و seb، 3/1 درصد ژن sec داشتند
در این مطالعه حضور ژنهاي کد کننده انتروتوکسینهاي A و C مورد بررسی قرار گرفت. بررسی حضور ژنهاي جدید کدکننده انتروتوکسینها در مطالعات بعدي میتواند نتایج این مطالعه را کاملتر کند. علاوه بر این همانطور که قبلا ذکر شد تنها صرف حضور ژنهاي انتروتوکسین نمیتواند بیانگر وقوع 100 درصد مسمومیت غذایی باشد زیرا امکان فراهم نشدن شرایط بیان ژنهاي فوق وجود دارد. بررسی میزان انتروتوکسینها در نمونههاي مورد بررسی میتواند نشان دهد که کدام یک از ژنهاي موجود توانستهاند تولید مقادیر قابل اندازهگیري انتروتوکسین نمایند.
