بخشی از مقاله
چکیده:اشرشیا کلی سروتایپ E.coli O157:H7 یکی از عوامل اصلی ایجاد کننده مسمومیتهای غذایی و بیماریهایی مانند اسهال، کولیت خونریزی دهنده، سندرم اورمی همولتیک، پورپورای ترومبوسیتوپنیک و حتی مرگ در انسان است. این آلودگی در محصولات گوشتی یافت میشود و علت آن علاوه بر آلودگی گوشتها با مدفوع آلوده،عدم رعایت موارد بهداشتی در کارخانجات است. طیوری مانند مرغ، بلدرچین و مرغابی آلودگی های نسبی را به E.coli O157:H7 دارا بودند و گوشت شترمرغ نیز در حد کمی آلودگی به این میکروارگانیسم را نشان داد.
در این پژوهش کودهای حیوانی آلودگی نسبتاً بالایی را به این میکروارگانیسم دارا بودند اما سبزی های خام آلودگی کمتری داشتند و در سبزیهای ضدعفونی شده آلودگی مشاهده نگردید. برخی از محصولات به مدت 35 دقیقه تحت فرایند حرارتی جوشاندن در آب قرارگرفتند. پس از آن از مراکز آنها نمونهبرداری صورت پذیرفت. روش جداسازی به دو صورت کشت بر روی کروم آگار اختصاصی و m-PCR میباشد.ژنهای جداسازی شده در روش PCR به تفکیک مشخص گردیدند که ژن stx2 بیشترین سهم را دارا بود.
مقدمه
اشرشیا کلی سروتیپ E.coli O157:H7 برای اولین بار در سال 1982 در پی ابتلای 42 نفر به اسهال خونی به دنبال خوردن همبرگر آلوده در رستورانهای زنجیرهای در ایالت میشگان و اورگان آمریکا جداسازی گردید . - Chinyu & Lawrence, 1995 - E.coli O157:H7احتمالاً خطرناکترین پاتوژن روده ای است که میکروب شناسان بالینی در کشورهای توسعه یافته با آن روبرو هستند . - Booth & Rowe, 1993 - در طول زمستان 1992-1993، چهار ایالت غربی واشنگتن، ایراهو، ناوادا و کالیفرنیا بزرگترین شیوع عفونت E.coli O157:H7 را تجربه کردند .
در آمریکای شمالی 723 آلودگی به این میکروارگانیسم مشاهده شد که 55نفر آن که اکثراً بچهها بودند به HUS پیشرفت کرد و منجر به مرگ چهار نفر گردید. همبرگرهای یک رستوران فستفودی به عنوان تنها عامل عفونت شناخته شد . - Bell et al, 1994 - شیوع E.coli O157:H7 اروپایی در اسکاتلند مرکزی در سال 1996 مشخص شده است، 501 نفر پس از مصرف گوشت از یک مغازه قصابی بیمار شدند و 20 نفر مردند. شایع ترین و پرشیوعترین STEC در آمریکای شمالی و ایالات پادشاهی در ارتباط با مصرف همبرگرها ودیگر محصولات گوشت گاو بوده است . - Bell et al, 1994 - گزارشات مختلف حاکی از پایین بودن دوز عفونی وروتوکسین O157:H7 میباشد.
در سال 1997 گزارش گردید که خوردن غذای حاوی کمتراز 10 میکروارگانیسم می تواند منجر به بروز عفونت گردد . - Doyle et al , 1997 - در مطالعات دیگر نشان داده شده است که وجود کمتر از 2 باکتری در 25 گرم از ماده غذایی برای ایجاد عفونت کافی است . - FSIS, 1993; Will Shaw et al , 1994 - در گزارشی در سال 1997، گوشت چرخ کرده و همبرگر عامل متداولی برای وقوع بیماریهای ناشی از E.coli O157:H7 بیان شد و کمیته تخصصی دامپزشکی، فرآوردههای تهیه شده از گوشت چرخ کرده گوساله به خصوص بیف برگر را به عنوان ماده غذایی با ریسک بالا جهت ایجاد بیماریهای ناشی از این میکروارگانیسم در نظر گرفت.
- SCV, 1997 - بعد از سال 1982، E.coli O157:H7 به عنوان عامل شیوع عفونت رودهای در کشورهای کانادا، انگلیس و آمریکا معرفی گردید . - Beutin et al, 2003 - گستره علائم کلنیکی آلودگی با این سویه وسیع است و اغلب تشخیص را دشوار میسازد. این میکروارگانیسم می تواند ایجاد آلودگی بدون علامت، اسهال، اسهال خونی، کولیت هموراژیک - HC - ، سندرم اورمی همولیتیک - HUS - ، ترومبوتیک ترومبوسیتوپنی پورپورا - TTP - و مرگ نمایدمعمولاً. در ابتدای بیماری اسهال بدون خون است اما سپس دردهای شکمی ایجاد می شود. در برخی بیماران تب کوتاه مدت دیده میشود. بیماری در نیمی از افراد در طی دوره اسهال بدون خون، با استفراغ وحالت تهوع همراه است.
در مدت 1 تا 2 روز اسهال خونی میشود و دردهای شکمی افزایش مییابد. این مرحله بین 4 تا 10 روز طول میکشد. در موارد شدید نمونه مدفوع به صورت کاملاً خونی درمیآید و دوره اسهال طولانیتر است. HUS معمول ترین علت نقص کلیوی در کودکان است که در حدود %15 موارد آلودگی با E.coli O157:H7 اتفاق میافتد و تقریباً یک هفته پس از اسهال شروع میشود - Ake et al , 2005; Bidet et al , 2005; . - Rivas et al, 2003 خصوصیات واگیری اصلی گونههای STEC، تولید مواد سمی شیگا و توانایی ساکن شدن در روده از طریق چسبندگی پروتئین داخلی که مسئول بستن و زدودن جراحتها و زخمها در مخاط رودهای است را دارد .
- Garcia-Aljaro et al, 2004 - لیست مواد انتقال دهنده عفونت E.coli O157:H7 شامل گوشت گوساله بریان شده، گوشت گاو خشک شده و گوشت خوک و شیرخام میباشد. تولیدات حیوانی از منابع گاوی به عنوان مثال شیرخام گاو وگوشت خشک شده به عنوان وسیله انتقال عفونت شناخته شدهاند . - Karch et al, 1999 - هدف از این پژوهش اگاهی از میزان آلودگی احتمالی گوشت مرغ، مرغابی، شترمرغ، بلدرچین و کودهای حیوانی مصرفی در مزارع به این میکروارگانیسم خطرناک است.
مواد و روشها
نمونهبرداری جهت انجام کشت از گوشت های مرغ، مرغابی، شترمرغ به صورت جداگانه در شرایط استریل نمونهبرداری انجام گردید. نمونهبرداری بدینصورت انجام پذیرفت که از مرغ ها در انتهای خط کشتار 85 نمونه از سطوح و مراکز مرغها برداشته شد. 50 مرغابی مورد آزمون در بستههای منجمد نمونهبرداری شد. بلدرچین ها نیز در بسته بندی منجمد بودند که از چند فروشگاه زنجیرهای جمعآوری گردید و تعداد 100 عدد نمونهبرداری صورت پذیرفت. جهت نمونهبرداری از کودهای حیوانی از سه مزرعه کشت سبزیجات 100 مورد جمعآوری گردید.
به صورت تصادفی در سه مزرعه، از سبزی های کشت شده 100 مورد نمونهبرداری انجام گردید. پس از استفاده از مایع ضدعفونی کننده بنزالکونیم کلراید %10 به مدت 15 دقیقه در ارتباط با نمونه های سبزی، آنها مجدداً مورد ارزیابی قرار گرفتند . مرغها، مرغابی ها، شترمرغها و بلدرچین های مورد آزمون پس از 35 دقیقه جوشیدن در آب و آبپز شدن مجدداً مورد ارزیابی قرار گرفتند . نمونهبرداری از موارد آبپز شده از مرکز آنها صورت پذیرفت. در تمامی موارد فوق از هر نمونه 25 گرم جداسازی گردید و دوباره غنیسازی صورت پذیرفت. این غنیسازی جهت کشت بر روی محیط کروم آگار اختصاصی E. coli O157:H7 صورت پذیرفت.
غنیسازی و کشت بر روی محیط اختصاصی کروم آگار E.coli O157:H7
جهت تشخیص بهتر و کاملتر وجود E.coli O157:H7 در نمونه های مورد بررسی، در دو مرحله غنیسازی صورت می پذیرد. غنی سازی اولیه نمونه ها با محیط لاکتوز براث مقدور میگردد. جهت این امر 25 گرم از نمونهای برداشته شده از هر بسته را در شرایط کاملاً استریل وارد ارلن حاوی 225 میلی لیتر محیط لاکتوز براث نموده و درب آن بسته میگردد و در حدود 10 دقیقه صبر نموده تا نمونهها بهتر و کاملتر حل گردند. سپس محیط لاکتوز براث حاوی نمونه را وارد انکوباتور می شود و 24 ساعت گرمخانه گذاری را در دمای 37 درجه انجام داده و سپس یک میلیلیتر از لاکتوز براس حاوی نمونه را برداشته تا آن را به مرحله غنیسازی ثانویه منتقل ساخت.
سپس یک میلی لیتر از محیط غنی شده در مرحله قبل وارد 9 میلیلیتر سلنیت سیستئین می گردد. در مرحله بعد 18 ساعت محیط ساخته شده جدید را در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار میگیرد. در ابتدای کار رنگ سلنیت سیستئین بیرنگ است اما در انتهای گرمخانه گذاری رنگ آن به قرمز تبدیل میشود.جهت به دست آوردن محیط کشت اختصاصیتر محلول تلوریت پتاسیم را به محیط کشت اضافه مینماییم تا به غلظت 2/5 میلیگرم بر لیتر در دمای 48 درجه سانتی گراد برسد.
یک لوپ از محیط غنی شده ثانویه را برداشته و در شرایط کاملاً استریل برروی محیط کشت اختصاصی کروم آگار به صورت خطی کشت انجام میگیرد. سپس محیط را به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتیگراد قرار میدهیم. کلنیهای ارغوانی رنگ بوجود آمده نشان از وجود E.coli O157:H7 در نمونه است . - Stampi et al, 2004 - لازم به ذکر است که این محیط کشت اختصاصی عمل مینماید - Afnor & Alonso, 2004; Hara-Kudu et al , 2002 - و مشکلات محیطهای کشت مککانگی آگار سوربیتول را ندارد . - Vander zant & Spiltts toesser, 1992 - در مرحله بعد نمونههایی که در مرحله تلقیح بر روی کروم آگار اختصاصی E. coli O157:H7 مثبت بودند را جدا ساخته و غنیسازی نموده تا جهت انجام Multiplex PCR آماده گردند. همچنین تمام نمونههایی را که بر روی محیط کشت تلقیح نموده را تحت تشخیص m-PCR قرار داده تا نتایج با هم مقایسه گردند.
غنیسازی نمونهها جهت m-PCR
نمونهها را در Modified Tryptic Soy Broth - M-TSB - حاوی Cefixime 0.05 mg/l کشت داده و آنها را در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 تا 24 ساعت در انکوباتور قرار داده - Oksuz et al , 2004 - سپس هر کدام از آنها به روش زیر مورد آزمون قرار میگیرند. خالص سازی ژنوم برای استخراج و تخلیص DNA ژنومیک از روش - Cetyltrime Thylammonium Bromide - CTAB استفاده گردید. برای این منظور 1/5 میلیلیتر از محیط نمونه غنی شده را به یک Microtube تمیز منتقل ساخته و عمل سانتریفوژ، در 5000 pm به مدت 5 دقیقه انجام میگیرد.
سپس رسوب - pellet - حاصل شده را در 567 میکرولیتر l بافر - 10 mM Tris Hcl, 10mM EDTA - TE، 30 میکرولیتر بافر 10 SDS درصد و 3 میکرولیتر آنزیم proteinase k - 20mg/ml - حل شده و سپس آنها را در دمای 37 °C به مدت 3 ساعت انکوبه کرده . سپس به مخلوط حاصل 100 l نمک 5 Nacl مولار و 80 l محلول 4/1 - CTAB/Nacl گرم Nacl، 10 گرم CTABو 80 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه - اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد نگهداری گردید، در مرحله بعد به مخلوط حاصل 780 میکرولیتر مخلوط کلروفرم-ایزوآمیل الکل - به نسبت 24 کلروفرم و 1 ایزوآمیل الکل - اضافه کرده و پس از تکان دادن به مدت 25 دقیقه در 2500 rpm سانتریفوژ شد.
محلول رویی به تیوب دیگری منتقل گردید و هم حجم آن مخلوط فنل-کلروفرم-ایزوآمیل الکل - به نسبت - 1/24/25 اضافه گردید و پس از عمل سانتریفوژ به مدت 25 دقیقه در rpm 2500، عمل ترسیب DNA به وسیله ایزوپروپانول و اتانول 70 درصد در دمای -20 °c انجام شد و در انتها DNA حاصل در 100 میکرولیتر بافر TE - pH=8 - و 3 میکرولیتر آنزیم Rnase A حل گردید . - Sambrook & Russell, 2001 - اندازهگیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده برای این منظور از دستگاه UV Spectrophotometer استفاده شد. برای اندازه گیری میزان جذب نمونه DNA ژنومیک ابتدا ژنوم به نسبت 4به پنجاه با آب مقطر رقیق شد.
جهت شناسایی ژنهای stx2, stx/stx1، پرایمرهای اختصاصی برنامهریزی شدهاستفاده گردید - جدول . - 1 پرایمرهای SFI و SRI قطعهای را تکثیر خواهند کرد که این قطعه مربوط به ژن آنزیم مالات دهیدروژناز میباشد و به عنوان کنترل مثبت داخلی از آن استفاده گردید. برای بررسی خصوصیات این قطعات و پرایمرهای آن از نرمافزار مولکولی Oligo، BLAST و DNASIS استفاده گردید. برای انجام فرایند 0/5 m-PCR میکرولیتر از DNA تخلیص شده باکتری E. coli O157:H7 - با غلظت - 210 ng/ l با 24/5 میکرولیتر از دیگر اجزا واکنش PCR مخلوط گردید. این اجزا عبارتند از:
1 . 1 میکرولیتر از هر یک از پرایمرها با غلظت 5 Pmol/ l - در مجموع 6 میکرولیتر - .
1 . 2 میکرولیتر از مخلوط dNTP با غلظت 2/5 mM، 3/8 میکرولیتر Mgcl2 با غلظت .10mM
2/ 5 .3 میکرولیتر از 10 X PCR buffer، 10/9 میکرولیتر آب مقطر استریل - DDW - و 0/3 میکرولیتر آنزیم unit/ l - Taq DNA polymerase . - 5 برنامه PCR شامل یک مرحله واسرشت در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 20 چرخه تکثیر 95 - DNA درجه سانتیگراد 1 دقیقه،
