بخشی از مقاله
چکیده
اشریشیا کلی یکی ازمهمترین عوامل ایجادکننده گاستروانتریت به ویژه در کودکان می باشد که ازطریق موادغذایی با منشاء دامی وتماس باحیوانات اهلی به انسان منتقل می شود.E. coli O157:H7 برجسته ترین سروتیپ شناخته شده ي خونریزي دهنده ي روده اي ، عامل کولیت خونریزي دهنده وسندرم اورمی همولیتیک می باشد . این مطالعه با هدف تعیین فراوانی حضور برخی ژن هاي حدت در سویه هاي E. coli جدا شده از شیرخام و فرآورده هاي سنتی آن دراستان فارس به روش PCR چندگانه اي انجام شد.
مجموعا 200 نمونه ، شامل40 نمونه شیرخام گاو، 20 نمونه شیرخام گوسفند ، 20نمونه شیرخام بز، 10نمونه شیرخام گاومیش ، 40 نمونه دوغ ، 11نمونه پنیرگوسفند ، 10 نمونه بستنی ، 14نمونه ماست ، 10نمونه کره ،10نمونه کشک ، 8 نمونه قره قروت ، 7 نمونه لورك موردبررسی قرارگرفت که از میان آنها 16 نمونه 8 - درصد - آلوده به باکتري E. coli بود ولی هیچ یک ازسویه هاي جداشده متعلق به سروتیپ O157:H7 نبودند . مطالعه حاصل از ردیابی ژن هاي حدت درسویه هاي E. coli جداشده نشان داد فراوانی حضور ژن هاي 3/5= stxIدرصد ، 2/5=stxII درصد ، cnf 6= درصد، 6=aer درصد، 3=hly درصد و 0= eae A درصد می باشند . نتایج این مطالعه نشان داد شیرخام وبرخی فرآورده هاي سنتی آن می توانند یکی ازمنابع مهم این پاتوژن براي انسان باشند .
مقدمه
اشریشیا کلی میکروفلورطبیعی روده انسان و جانوران خونگرم می باشد . E. coli O157:H7 مهمترین سروتیپ سویه هاي انترو هموراژیک اشریشیا کلی - EHEC - می باشد که در بیماري هاي منتقل شونده بوسیله مواد غذایی نقش دارد.این سروتیپ توکسین زا بوده وداراي ژن هایی نظیر stxI ، stxII ، eaeA ، hly وچند ژن دیگر می باشد که در بیماري زایی این سویه نقش اساسی ایفا می کنند. پس ازگزارش توسط Riely وهمکارانش در سال 1983 ، موارد تک گیري و همه گیري هاي بسیاري از سویه هاي EHEC گزارش گردید.
اولین بار این ارگانیسم در ایالات متحده شناسایی شد. اما موارد مهمی از همه گیري هاي ناشی از این باکتري در سطح جهان مشاهده شده است. میزان موارد تائید شده ي آلودگی به سروتیپ O157:H7 در سال 2007 دراسکاتلند 9 مورد ، ودر سال 2008 در ویرجینیاي آمریکا 25 مورد بوده است. همچنین درمیشیگان 21 مورد، ودراوهایو 19مورد آلودگی به این سروتیپ در سال 2008 تائید شده است - . - 4 برخلاف شیوع کمتر بیماري هاي اسهالی در کشورهاي توسعه یافته ، همچنان اسهال هاي باکتریایی یکی ازمهمترین بیماریهاي عفونی کشورهاي در حال توسعه از جمله ایران بشمار می آید. مطالعات متعدد نشانگر این است که آلودگی به سویه هاي انتروهموراژیک بویژه سروتیپ O157:H7 اغلب از طریق موادغذایی با منشاء دامی مانند گوشت ، شیرخام وفرآورده هاي آن به انسان منتقل می گردد.
بنابراین گاوسانان به عنوان منابع اولیه باکتري در نظر گرفته می شوند - 1 ، 10 ، . - 11 در تمامی افراد احتمال آلودگی با این باکتري وجود دارد، اما کودکان وافراد مسن مستعدتر هستند. در خصوص جدا سازي سروتیپ E. coli O157:H7 بویژه از فرآورده هاي گوشتی در ایران در چند ساله اخیرمطالعات متعددي صورت گرفته امادر خصوص ردیابی این باکتري در فرآورده هاي لبنی سنتی مطالعات جامعی انجام نشده است. لذا باتوجه دوز عفونی بسیاراندك این باکتري - کمتر از 100 ارگانیسم - درمقایسه با سایرپاتوژن هاي روده اي، مطالعه حاضرباهدف جداسازي سویه هاي مختلف E. coli بویژه O157:H7 از شیر خام و فرآورده هاي لبنی سنتی آن و تعیین فراوانی انواع ژن هاي حدت این باکتري طرح ریزي شده است .
مواد و روش ها :
نمونه گیري : در طول زمستان 1389 و بهار 1390 مجموعا 200 نمونه شامل40 نمونه شیرخام گاو،20 نمونه شیرخام گوسفند ،20 نمونه شیرخام بز، 10 نمونه شیرخام گاومیش ، 40 نمونه دوغ ، 11 نمونه پنیرگوسفند ، 10 نمونه بستنی، 14 نمونه ماست ،10 نمونه کره ،10 نمونه کشک ، 8 نمونه قره قروت ، 7 نمونه لورك - فرآورده اي حاصل از حرارت دادن آب پنیر - ، تهیه ودر شرایط استریل به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه آزاد شهرکرد انتقال داده شد .
جداسازي باکتري: E. coli جداسازي باکتري به روش کشت میکروبی روي محیط هاي اختصاصی میکروبیولوژي انجام شد. ردیابی حضور ژن هاي حدت در : E. coli جهت ردیابی حضورعوامل حدت در سویه هاي E. coli از روش PCR چندگانه اي استفاده شد . براي این منظور باکتري هاي جدا شده به مدت 24 ساعت در محیط پپتون واتر کشت وبا استفاده از کیت - Fermentas - Genomic DNA Purification ، DNA باکتري ها استخراج گردید.
آزمایش : PCR با استفاده از دستگاه Master Cycler Gradient - Eppendorf - انجام ودر هر مرحله محصول PCR روي ژل 1.5درصد آگاروز حاوي اتیدیوم بروماید در ولتاژ ثابت 80 ولت الکتروفورز واز ژل حاصله با دستگاهUVidoc عکس برداري ونتایج ثبت گردید. جدول شماره 1 توالی پرایمرهاي مورد استفاده و برنا مه هاي حرارتی PCR در این پژوهش را به تصویر می کشد .
نتایج :
از مجموع 200 نمونه مورد مطالعه 16 نمونه در آزمایشات باکتري شناسی آلوده به باکتري E. coli تشخیص داده شد که هیچ یک از سویه هاي جدا شده متعلق به سروتیپ O157:H7 باکتري E. coli نبودند. نتایج حاصل از حضور E. coli وعوامل حدت آن در نمونه ها به تفکیک در جداول 2 و 3 آورده شده ا ست .
بحث :
اشریشیا کلی به عنوان بخشی از فلور میکروبی روده انسان وبسیاري از حیوانات نقش مهمی در میکروب شناسی غذا وآب به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی برعهده دارد. سروتیپO157:H7 این باکتري از جمله سویه هایی است که درسالهاي اخیر باعث بروزهمه گیري هایی دربرخی نقاط جهان شده وتوجه محققان ودست اندرکاران بهداشتی را به خودمعطوف نموده است. با توجه به اینکه عامل اصلی انتشار E. coli O157:H7 گاوسانان و محصولات غذایی با این منشاء می باشد، بیشترمطالعات موجود مربوط به آلودگی این محصولات بوده ا ند. شیر وفرآورده هاي آن سهم بسزایی در انتقال این پاتوژن به انسان داشته ومطالعات مختلفی درایران وخارج از ایران درخصوص بررسی شیوع این باکتري در فرآورده هاي دامی به ثبت رسیده است.
بنیادیان وهمکاران - 1386 - فراوانی حضور سروتیپ O157:H7 اشریشیاکلی را درشیرخام گاو در استان چهارمحال وبختیاري 9 مورد از200 نمونه مطالعه شده گزارش کردند - . - 2 سروتیپ هاي مختلف E. coli ژن هاي حدت مختلفی را کد می کنند که در بیماري زایی این اجرام نقش بسزایی دارد. در سال2007 در آمریکا، 859 نمونه شیر از 21 ایالت از نظر حضورO157:H7 و ژن هاي حدت کد شده توسط این باکتري مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه 5 نمونه شیرآلوده به سروتیپ O157:H7 بود و فراوانی حضورژن% eaeA =23 وژن هاي stxII و stxI معادل 4/2درصد گزارش گردید - . - 6 در سال 2006 در چین 6 نوع غذاي مختلف از نظر آلودگی بهE. coli O157:H7 ونقش فاکتور فصل در توزیع آلودگی به این باکتري بررسی شد.
از1463 نمونه گوشت خام، سبزیجات تازه و شیر3/3درصدآنها آلوده بهE. coli O157:H7 بود اما از نمونه هاي ماست این ارگانیسم جدا نشد. در این بررسی درصدحضورنمونه هاي مثبت در تابستان 2/5 - درصد - نسبت به زمستان 1/1 - درصد - بیشتر بود - . - 8 مطالعه حاضردر سطحی گسترده جهت بررسی میزان آلودگی شیر خام و فرآورده هاي سنتی آن به سروتیپO157:H7 اشریشیاکلی وتعیین حضور ژن هاي حدت درجدایه هاي E. coli این فرآورده ها انجام گرفت.
براي این منظور200 نمونه از شیرهاي خام وفرآورده هاي لبنی سنتی عرضه شده در سطح استان فارس از نظر آلودگی به E. coli وسروتیپ O157:H7 آن ونیز ردیابی حضورژن هاي حدت در سویه هاي جداشده از این فرآورده ها بررسی شد. نتایج نشان داد پنیر گوسفند با36/4 درصد آلودگی بیشترین آلودگی به E. coli را در نمونه هاي بررسی شده دارا می باشد ا ما هیچ یک از سویه هاي جدا شده از فرآورده هاي مورد بررسی جزء سرووارO157:H7 نبودند.
