مقاله جداسازی اشرشیاکلی O157 : H7 از گوشت تازه بوقلمون های عرضه شده در فروشگاه های شهر اصفهان با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR )

بخشی از مقاله

جداسازی اشرشیاکلی O157:H7 از گوشت تازه بوقلمون های عرضه شده در فروشگاه های شهر اصفهان با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
چکیده
باکتری اشرشیاکلی یکی از عوامل اصلی بروز فساد در مواد غذایی خصوصاً گوشت طیور است. اشرشیاکلی O157:H7 به عنوان یک عامل اسهال، کولیت خونریزی دهنده و سندرم اورمی همولیتیک در سراسر جهان شناخته شده است. گوشت آلوده به مدفوع حیوانی احتمالاً منبع اصلی عفونت اشرشیاکلی O157:H7 در نمونههای گوشت است. این مطالعه باهدف بررسی میزان شیوع اشرشیاکلی O157:H7 در نمونههای گوشت بوقلمون عرضه شده در فروشگاههای شهر اصفهان صورت گرفت. این مطالعه به صورت تصادفی، در مهرماه 1392 انجام پذیرفت. در این مطالعه تعداد 30 گوشت بوقلمون مورد بررسی قرار گرفت. نمونهها از برش سطحی عضله سینه گرفته شد و پس از نمونه برداری سرعاًی توسط تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان آلودگی نمونه ها به اشرشیاکلی تعداد 3 نمونه 10)درصد) در آزمون PCR به عنوان به اشرشیاکلی O157:H7 تشخیص داده شدند، که بسیار قابل توجه است. نتایج این مطالعه نشان داد که گوشت بوقلمون میتواند به عنوان یک مخزن بالقوه برای اشرشیاکلی O157:H7 مطرح باشد و گوشت بوقلمون ممکن است به عنوان یک حامل در انتقال این پاتوژن به انسان عمل کند. توصیه میشود که از روشی سریع، دقیق و بیخطر واکنش زنجیرهای پلیمراز به منظور کنترل بهداشت گوشت طیور از نظر وجود پاتوژن هایی مثل اشرشیاکلی استفاده کنیم.
واژههای کلیدی
اشرشیاکلی، گوشت بوقلمون، اصفهان، O157:H7، PCR

-1 مقدمه
باوجود تمام پیشرفتهایی که در صنعت پرورش طیور صورت گرفته است، بیماری های منتقلشده از طریق مصرف گوشت آلوده، اقشار مختلفی از جامعه را درگیر خود کرده است 1) و (2؛ که دلیل اصلی وقوع این بیماری هااحتمالاً عدم رعایت بهداشت در مراکز عمل آوری و پخش گوشت طیور و هم چنین عدم انجام کنترل و بازرسی موثر در کشتارگاههای طیور است. به همین دلایل مشخص شدن میزان آلودگی گوشت طیور که سرشار از منابعی متعدد معدنی، پروتئین و ویتامین بوده، بسیار اهمیت دارد. در بین حیوانات گاو به عنوان مهمترین مخزن این باکتری هست .(3) اگرچه گوسفند، بز، خوک، سگ، گربه، بوقلمون، جوجه، غاز و ماهی نیز به عنوان مخازن این باکتری گزارش شدهاند 4) و .(5
از بین مطالعات صورت گرفته در این زمینه، توانایی بالای باکتری اشرشیاکلی به عنوان عاملی برای فساد گوشت طیور، به کرار گزارش شده است 1) و .(2 اشرشیاکلی مهمترین پاتوژن رودهای گرم منفی و میله ای شکلی است که به عنوان مسمومیت غذایی انواع غذاها در انسان مطرح است 1)، 2 و .(6 تیپهای متفاوت این باکتری عبارتند از اشرشیا کلی توکسین زای رودهای (ETEC)، اشرشیا کلی پاتوژنی روده ای (EPEC)، اشرشیا کلی چسبنده روداه ی (EAEC)، اشرشیا کلی متهاجم رودهای (EIEC) و اشرشیا کلی خونریزی دهنده رودهای .(7) (EHEC) تیپ EHEC شامل یک تحت تیپ مهم به نام اشرشیا کلی تولیدگر شیگا توکسین (STEC) میشود .(7)
اشرشیاکلی های STEC علاوه بر این که از موارد فساد گوشت جداسازی شدهاند، عامل ایجاد اسهال خونی و غیر خونی، ترومبوسیتوپنی، کولیت خونریزی دهنده (HC)، سندرم همولیتیک اورمیک (HUS)، آنمی همولیتیک و اختلالات کلیوی حاد هستند .(8 -10)
چندین سویه از باکتری اشرشیاکلی به عنوان پاتوژنهای بالقوه در غذا معرفی شدهاند. یکی از سویههای مهم آن، سویه اشرشیا کلی O157:H7 است که به عنوان یکی از عمدهترین سویههای بیماریزای انسان معرفی شده است. سویه اشرشیا کلی O157:H7 سالانه باعث بروز چندین مورد مرگ شده و از طریق مواد غذایی مختلف خصوصاً مواد غذایی با منشأ دامی به انسان منتقل میشود 6)و .(11
به دلیل اهمیت بالای مصرف گوشت طیور در ایران، مطالعه حاضر را به منظور جداسازی باکتری اشرشیاکلی O157:H7 جدا شده از گوشت بوقلمونهای شهر اصفهان، انجام پذیرفت.
-2 مواد و روش کار
-2-1 نمونهها و جداسازی اشرشیا کلی
در مهرماه سال 1392، 30 نمونه گوشت بوقلمون از مراکز فروش شهر اصفهان به طور تصادفی انتخاب گردید. قبل از نمونه گیری به منظور از بین بردن آلودگی سطحی، سطح گوشت با الکل %70 ضد عفونی شد. کلیه نمونهها از گوشت عضله سینه بوقلمونها گرفته شد و نمونهها با رعایت شرایط بهداشتی کامل در یخچال حاوی یخ به شکل جداگانه سرعاًی به مرکز تحقیقات کنترل کیفی مواد غذایی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد.
در ابتدا سطح عضله سینه با آنس داغ و استریل ضد عفونی شد و از عمق عضله برای کشت به محیط EMB agar (Merck, Germany) انتقال یافتند و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شدند. پرگنه های سبز متالیک رشد کرده در محیط EMB agar به عنوان باکتری اشرشیاکلی تیپیک مورد پذیرش قرار گرفتند. به منظور تایید تشخیصی از روش واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) که در سال 2000 توسط (12) Sabat et al., ارائه شده بود، استفاده شد.
-2-2 استخراج DNA
DNA ژنومی به وسیله کیت استخراج DNA شرکت سیناژن ایران و با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد و تا زمان انجام PCR در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
-3-2 ردیابی مولکولی
به منظور جداسازی اشرشیاکلی از روش PCR با استفاده از پرایمر های ارائه شده در جدول 1، استفاده شد. برای انجام آزمون PCR غلظت بهینه مواد به کار رفته در واکنش PCR در حجم 50 میکرولیتر شامل 5 میکرولیتر بافر PCR با غلظت 10X، 2 میلی مولار MgCl2، 200 میکرون مولار dNTP، 2 میکرومولار از هر پرایمر، 1 واحد آنزیم DNA پلیمراز Taq، 1 میکروگرم DNA از هر نمونه بود. سپس از افزودن اجزای PCR حجمهای فوق لوله در داخل دستگاه ترموسایکلر (Mastercycler Gradient, Ependorf, Germany ) قرار داده شدند و برنامه حرارتی به صورت زیر تنظیم شد: یک سیکل 94 درجه سانتیگراد برای 6 دقیقه، 34 سیکل 94 درجه سانتیگراد برای 1 دقیقه، 58 درجه سانتیگراد برای یک دقیقه، 72 درجه سانتیگراد برای 1 دقیقه و یک مرحله نهایی 72 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه. در تمام واکنشهای PCR، از آب مقطر سترون به عنوان کنترل منفی واکنش، استفاده شد.
-2-4 اکتروفورز محصولات PCR
در آزمون PCR از ژل آگارز یک درصد استفاده گردید برای این منظور یک گرم پودر آگارز در 100 میلی لیتر با فرم TBE 1× ذوب و پس از رسیدن درجه حرارت محلول به حدود 50 درجه سانتیگراد 5 میکرولیتر رنگ اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید و در سینی مخصوص الکتروفورز (Cast) قرار داده شد. برای این منظور سینی حاوی ژل در تانک الکتروفورز قرار گرفت و مقداری بافر TBE 1 × در تانک اضافه شد تاکاملاً سطح ژل را فراگیرد. سپس 15 میکرولیتر محصول PCR با 20 میکرولیتر محصول رنگ نشانگر (loading) مخلوط و در چاهک ژل منتقل گردید.
نشانگر DNA (مارکر) هم به میزان 3l به منظور تعیین وزن باندهای به دست آمده در چاهک مجاور استفاده شد. الکتروفورز نمونهها در ولتاژ ثابت 90ولت به مدت حدوداً یک ساعت انجام گرفت.