بخشی از مقاله
چکیده
سویه های انتروهموراژیک اشریشیاکلی ازمهمترین پاتوژنهای روده ای ایجادکننده بیماری های منتقل شونده به وسیله مواد غذایی درانسان محسوب می شوند. هدف از این پژوهش، جداسازی وشناسایی E.coli O 157:H7 از گوشت گاوهای کشتار شده درکشتارگاه شهرکازرون و تعیین الگوی مقاومت دارویی باکتری های جدا سازی شده می باشد.به همین منظور200نمونه گوشت ازگاوهای کشتارشده در سال 1393 ازکشتارگاه صنعتی شهرستان کازرون اخذگردیدوپس از نمونه برداری به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشکده دامپزشکی کازرون منتقل گشت.کشت وآنالیز میکروبی روی نمونه ها صورت گرفت وکلنی های مشکوک به اشرشیاکلی O157:H7 توسط تکنیک PCR ارزیابی شد.
ومقاومت آنتی بیوتیکی سویه ها باروش دیسک دیفیوژن مورد ارزیابی قرارگرفت. نتایج نشان داد ازمجموع 200 نمونه مورد بررسی تنها 3 نمونه 1/5 - درصد - ، هر 3 در فصل تابستان آلوده به اشرشیاکلی O157:H7 بودند. تمامی باکتری ها در برابرآنتی بیوتیک های پنی سیلین ،اریترومایسین وآمپی سیلین مقاومت داشتند. درصد بالای به دیگرآنتی بیوتیک ها مقاومت نشان دادند؛ 66/66 درصد به سفالکسین و جنتا میسین مقاوم بودند. ولی تمامی باکتری های جداسازی شده به کلرآمفینیکل حساسیت نشان دادند.مطالعه حاضرنشان داد اشریشیاکلی O157:H7 زئونوزی خطرناک است که به علت عدم بیماری زایی دردام ومصرف بی رویه آنتی بیوتیک درصنعت پرورش می تواند مقاومت شدید آنتی بیوتیکی را ایجاد نماید.
مقدمه
کلی باسیلوزیس بیماریی است که توسط باکتری اشریشیاکلی - E.coli - ایجاد می شود وهمچنین با نام خونریزی مخاط روده ی بزرگ - - Hemorrhagic colitisشناخته شده است. E.coli O157:H7 مهمترین سروتیپ سویه های انتروهمراژیک اشریشیاکلی - EHEC - است که درایجاد بیماری های منتقل شونده به وسیله موادغذایی نقش دارد - . - 1در بین حیوانات گاو به عنوان مهمترین مخزن این باکتری می باشد و نکته مهم عدم بیماری زایی این سویه - E.coli O157:H7 - درگاو می باشد 1 - ،. - 2 اگرچه گوسفند، بز،خوک، سگ، گربه، بوقلمون، جوجه و غاز نیز به عنوان مخازن این باکتری گزارش شده اند
4 - ،3،. - 1 آلودگی های سویه های انتروهموراژیک به ویژه سروتیپ E.coli O157:H7 اغلب به واسطه مصرف همبرگر، گوشت چرخ کرده ، شیر خام ودیگر محصولات گاوی می باشد. حشرات نیز در نتیجه ارتباطی که با کود و مدفوع حیوانات دارند باعث انتشار این باکتری می شوند. حشرات نقش مهمی را در اکولوژی وانتقال این پاتوژن درماههای تابستان دارند . در تمامی افراد احتمال آلودگی با این باکتری وجوددارد، اماکودکان و افراد مسن مستعد تر هستند5 - ×،7،. - 6 در سال 1993 گزارشی مربوط به آلودگی 732 نفردرآمریکا که منجربه مرگ 4 نفر گردید که همبرگر نیم پزعلت آن معرفی گردید - . - 8 درگزارش دیگری درسال1997،گوشت چرخ کرده وهمبرگرعامل
متداول برای وقوع O157:H7 E.coli بیان شد - . - 9 هموژن بودن این سویه از نظر ژنتیکی سبب یافتن روش های زیادی برای جداسازی این سویه ها نظیر عدم قدرت تخمیر سوربیتول و عدم تولید بتا.دی. گلوکورونیداز است که بیشتر انواع اشرشیا کلی قادر به انجام دادن آن می باشند. از این جهت باساختن محیط های انتخابی نظیر سوربیتول مکانکی آگار، سفیکسیم پتاسیم تلوریت رامنوز میتوان این سویه ها راغربالگری کرد . ازدیگر روش ها روش ملکولی - - PCR می باشد، که درسالهای اخیر مورد توجه قرارگرفته است - . - 10 در مقایسه باسایرپاتوژن های رود ه ای به ویژه سالمونلا و شیگلا و مقاومت آن در برابر اکثر آنتی بیوتیک ها، ضرورت شناسایی منابع آلودگی و چگونگی انتقال آن به انسان وجود دارد.هدف ازاین پژوهش ، جداسازی وشناسایی E.coli O157:H7 ازلاشه گاوهای کشتار شده درکشتارگاه شهرکازرون وتعیین الگوی مقاومت دارویی باکتری های جدا سازی شده می باشد.
روش کار
این مطالعه توصیفی- تحلیلی ازفروردین تا بهمن 1393 انجام پذیرفت . درمجموع 200 نمونه ازلاشه های گاوهای کشتار شده در شهرکازرون جمع آوری گردید. نمونه گیری درانتهای خط کشتار ودرشرایط استریل ازبرش سطحی عضله گردن دراندازه 10×10×0/3 سانتیمتر انجام گرفت و پس ازهربارنمونه گیری نمونه هادرکناریخ وبارعایت اصول استاندارد به آزمایشگاه تخصصی میکروبیولوژی منتقل وحداکثرظرف 12 ساعت پس از نمونه گیری ازنظرآلودگی اشرشیاکلی O157:H7 مورد ارزیابی و مراحل جداسازی انجام پذیرفت. تعداد نمونه های اخذ شده د هر فصل50 عدد بودکه بر اساس مطالعات مشابه در نظرگرفته شد
11 - ،. - 10 جهت جستجوی اشرشیا کلی O157:H7، 10 گرم ازهرنمونه به صورت هموژن شده به 90 میلی لیترآبگوشت تریپتون سوی - TSB - ساخت شرکت مرک آلمان حاوی مکمل نووبیوسین - 20mg/l - اضافه شد و برای 18-24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. درادامه 100 میکرولیتر ازنمونه غنی شده مورد نظردرمحیط ائوزین متیلن بلو و مک کانکی سوربیتول دار - SMA - ساخت شرکت مرک آلمان حاوی مکمل سفکسیم و تلئوریت پتاسیم کشت و بمدت 24 ساعت درگرمخانه 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. جهت تائید تشخیص پرگنه های مشکوک اشرشیاکلی از کشت بر روی محیط تریپل شوگرآیرون - TSI - وآزمون آیم ویک - IM ViC - استفاده شد .
- 12 - همچنین پرگنه های سوربیتول منفی جهت تائید تشخیص اشرشیا کلی O 157:H7 به وسیله PCR با استفاده ازدو پرایمر مخصوص تشخیص ژن های O157 و - fiC - H7 مورد بررسی قرارگرفت 14 - و - 13 - جدول شماره . - 1 جهت استخراج DNA از کیت استخراج DNA ساخت شرکت سیناژن ایران استفاده شد.کمیت وکیفیت DNA استخراج شده به دوروش اسپکترومتری باطول موج 260 نانومتر والکتروفورز روی ژل آگارز1درصد مورد ارزیابی قرارگرفت. DNA استخراج شده تا زمان انجام PCR در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. - . - 10 در این مطالعه از سویه استاندارد آزمایشگاهی اشرشیاکلی O157:H7 به عنوان کنترل مثبت و ازآب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
برای تعیین حساسیت اشریشیاکلی جدا سازی شده به ترکیبات ضدباکتریایی، از روش انتشاردیسک استفاده گردید. ابتدا کلنی ها را درمحیط مایع مولرهینتون به نیم مک فورلان رسانده، سپس ازآن برروی محیط کشت مولر هینتون آگار، کشت تهیه کرده وهمزمان دیسک حاوی آنتی بیوتیک خریداری شده از شرکت پادتن طب برروی محیط کشت قرار داده شد. پس از 24ساعت انکوباسیون در دمای37 Cقطرهاله عدم رشد سالمونلاها تعیین گردید. برای آزمایش آنتی بیوگرام از4 دیسک آنتی بیوتیک شامل: پنیسیلین - - 10 g، آمپیسیلین - - 10 g ، تتراسیکلین - - 30 g ، کانامایسین - - 30 g وکلرآمنیکل - - 10 g استفاده شد - جدول . - 2 نتایج تعیین حساسیت اشریشیاکلی های جداسازی شده به ترکیبات ضد باکتریایی بر اساس درصد درسه سطح حساس، نیمه حساس ومقاوم - بر اساس جدول شرکت پادتن طب از تعداد نمونه های اشریشیاکلی - ارزیابی گردید - استفاده ازروش استاندارد . - 15 - - Kirby & Bauer
نتایج و بحث
نتایج نشان داد ازمجموع 200 نمونه مورد بررسی درمجموع109نمونه به باکتری های مختلف آلوده بودند.که 33 مورد - - %29,46 طبق آزمایشات میکروبی وبیوشیمیایی آلوده به اشریشیاکلی بود. ودر نهایت توسط تست تشخیصی PCR مشخص گردید 3نمونه از 33نمونه اشریشیاکلی سویه O157:H7 بود که هرسه نمونه آلوده مطعلق به فصل تابستان بود.نتایج حاصل ازبررسی حساسیت E.coli O157:H7 در برابرآنتی بیوتیک هانشان دهنده مقاومت تمامی باکتری ها در برابرآنتی بیوتیک های پنی سیلین، اریترومایسین وآمپیسیلین بود.همچنین درصدبالای به دیگرآنتی بیوتیک هامقاومت نشان دادند؛ 66/66 درصد به سفالکسین وجنتامیسین مقاوم بودند - جدول. - 2 ولی تمامی نمونه ها به کلرآمفینیکل حساس بودند.
با توجه به اینکه عامل اصلی انتشار اشرشیاکلیO157:H7 گاو وگزارش های موجود مربوط به آلودگی این محصولات بوده است - . - 16,17 شیوع این پاتوژن درگوشت و محصولات حاصل ازگوشت گاو بین0 تا 27/8 درصد گزارش شده است 18 - ،19،. - 17 در مطالعه حاضر مشخص گردید 1/5 درصد نمونه ها آلوده به اشریشاکلیO157:H7 بودند که با مطالعه ای که توسط تهمتن وهمکاران در سال 2006 درموردگوشت گوساله ها درکشتارگاه صنعتی شیرازصورت گرفته بودو نشان دادآلودگی در بین گوشت های کشتار شده وجود دارد اما این آلودگی درحد بالیی نمی باشد وبین صفر تا 8 درصد نوسان دارد - - 20 مطابقت دارد. همچنین با مطالعه دیگرکه درکشورهای مختلف صورت گرفته است آلودگی اشرشیاکلیO 157:H7 درگوشت گاوکشورهلند - 10/4% - ، انگلیس - 13/4% - آمریکا - 28% - بوده که از میزان اندازه گیری شده در این مطالعه بیشتر می×باشد ×29 - ،×21،. - 28 همخوانی دارد .
