بخشی از مقاله
چکیده
بیان ژنهاي مسﲑ گوگردزدایی در باکﱰي گوگردزداي Gordonia alkanivorans RIPI-90A به شدت توسط سولفات، فرآورده هنایی مسﲑ، مهار می گردد. استفاده از پروموترهایی که بوسیله سولفات مهار ﳕی شوند می تواند در افزایش فعالیت گوگردزدایی نقش موثري داشته باشد. ژهناي dszABC باکﱰي Gordonia alkanivorans RIPI-90A با استفاده از پراﳝرهاي اختصاصی تکثﲑ و کلون گردیده و سپس تواﱄ آهنا تعیﲔ شد. ژهناي dszABC ﲢت کنﱰل پروموتر lac کلون گردیده و با استفاده از شاتل وکتور pRSG43 به باکﱰي RIPI-90A منتقل و بیان شدند. سویه نوترکیب بدست آمده قادر به حذف گوگرد از دي بنزوتیوفن در حضور سولفات، متیونﲔ و سیستئﲔ است در حاﱄ که در ﳘﲔ شرایط، بیان ژنهاي سویه شاهد مادري به شدت مهار می شود. سرعت و میزان گوگردزدایی سویه نوترکیب نیز در مقایسه با سویه مادري افزایش قابل توجهی نشان می دهد.
کلمات کلیدي: گوگردزدایی زیسﱵ، کلون سازي ژن، بیان ژن، گوردونیا، باکﱰي نوترکیب
مقدمه:
ﲤامی سوختهاي فسیلی حاوي ترآیبات گوگردي هستند. اشتعال این سوختهاي فسیلی سبب رها شدن اآسیدهاي گوگرد به ﳏیط می شود آه از عوامل اصلی باراهناي اسیدي ﳏسوب می شوند و مشکلات متعددي را به ﳘراه دارند. به ﳘﲔ دلیل قوانﲔ مربوط به سطح ﳎاز گوگرد در سوخت-هاي فسیلی به صورت روز افزون در حال سخت تر شدن است به طوري آه میزان گوگرد ﳎاز در گازوئیل تا سال 2010 به میزان 10 ppm خواهد رسید . - 1 - هیدرودسولفوریزاسیون - - HDS فرآیندي شیمیایی است آه از گاز هیدروژن در دما و فشار بالا و در حضور آاتالیستهاي فلزي براي حذف گوگرد استفاده می ﳕاید و بطور متداول در پالایشگاهها مورد استفاده قرار می گﲑد.
در روش حذف زیسﱵ گوگرد - BDS - از توانایی متابولیک برخی میکروارگانیسمها براي حذف گوگرد از ترآیبات مقاوم نفﱵ ﳘانند دي بنزوتیوفن - DBT - و مشتقات آلکیله آن استفاده می شود. با توجه به اینکه BDS در دما و فشار معموﱄ اﳒام می گﲑد در مقایسه با HDS هزینه سرمایه اي و راهﱪدي آمﱰي را به ﳘراه خواهد داشت . - 2 - مسﲑ بیوشیمیایی حذف گوگرد از DBT آه با نام 4S نیز شناخته می شود در برگﲑنده دو آنزﱘ منواآسیژناز سیتوپلاﲰی DszA - و - DszC و یک دسولفیناز - DszB - است. ژنهاي آد آننده این آنزﳝها بصورت یک اپرون در آنار یکدیگر قرار گرفته اند و توسط پروموتر مشﱰك dsz رونویسی می شوند. بررسیها نشان داده است آه بیان ژهناي dszABC به شدت توسط سولفات و اسیدهاي آمینه گوگردي مهار می شود بنابراین فعال نگه داشﱳ این ژهنا در طی مراحل رشد باآﱰي بسیار مشکل است . - 1 -
به منظور حذف مهار سولفاتی و افزایش فعالیت گوگردزدایی، سویههاي گوگردزداي نوترکیب متعددي از ﲨله E.coli، Pseudomonas و Rhodococcus ﲥیه شده اند - 3 - ، اما استفاده از سویههاي نوترآیب Gordonia تاآنون گزارش نشده است آه می تواند ناشی از آمبود ابزارهاي دستورزي ژنتیکی این جنس باشد. جهت تبدیل BDS به فرآیند ﲡاري، افزایش توان گوگردزدایی در باآﱰیهاي گوگردزدا اجتناب ناپذیر است . در این مطالعه از روش جایگزیﲏ پروموتر جهت حذف مهار سولفاتی در باآﱰي گوگردزداي RIPI-90A استفاده شد. به دلیل ویژگیهاي مطلوب غشاء باآﱰيهاي گوگردزداي طبیعی از Self Cloning به جاي Heterologous Cloning جهت ساخت آاتالیست نوترآیب استفاده شد.
مواد و روشها
سویههاي باآﱰیایی مورد استفاده و شرایط آشت: باآﱰي G. alkanivorans RIPI-90A جهت استخراج DNA و به عنوان میزبان جهت ﳘسانه سازي ژهنايdsz مورد استفاده قرار گرفت. این باآﱰي در ﳏیط آشت پایه معدنی حداقل - MS - حاوي DBT به عنوان تنها منبع گوگرد و در دماي 30˚ C آشت داده شد. E.coli DH5α به عنوان میزبان براي آلونینگهاي عمومی مورد استفاده قرار گرفت و در ﳏیط آشت LB رشد داده شد. در صورت نیاز آنﱵ بیوتیکهاي آمپی سیلﲔ و آانامایسﲔ با غلظت 50 mg/l با ﳏیط آشت افزوده شدند. تکثﲑ ژهنايdsz بوسیله :PCR براي تکثﲑ ژهناي dsz از DNA ژنومی سویه RIPI90A پراﳝرهاي مناسب بر اساس تواﱄ شناخته شده ژهناي R.erythropolis - GenBank Accession No. U08850 - IGTS8 طراحی شدند. جهت ساخت اپرون مصنوعی dsz، 6 باز بﲔ ژهناي dszB و dszC با سایت برش HindIII جایگزین شد. پراﳝرهاي PF و PR براي تکثﲑ ناحیه اپراتور-پروموتر اپرون lac از پلاﲰید pUC18 مورد استفاده قرار گرفتند.
ساخت پلاﲰید نوترکیب :dsz با استفاده از DNA ژنومی RIPI90A پس از اﳒام PCR یک قطعه 2.5 kb براي ژهناي dszAB و یک قطعه 1.3 kb براي ژن dszC بدست آمد. این قطعات در وآتور آلونینگ pTZ57R آلون شدند و به ترتیب با آنزﳝهاي KpnI-HinIII و HindIII-XbaI برش داده شده و به یکدیگر متصل گردیدند تا اپرون مصنوعی dsz بدست آید. قطعه 240 bp اپراتور-پروموتر lac نیز پس از تکثﲑ با PCR با آنزﱘهاي HindIII-KpnI برش داده شده و به وآتور pRSG43 انتقال داده شد و پلاﲰید pRSG43L2 بدست آمد. این پلاﲰید با آنزﳝهاي KpnI-XbaI برش داده شد و ژهناي dszABC به آن متصل گردید و بدین ترتیب پلاﲰید نوترکیب pRSG43L2dszABC که در آن ژهناي dsz ﲢت آنﱰل اپراتور-پروموتر lac قرار داده شده است، ساخته شد.
ترانسفورماسیون :Gordonia alkanivorans براي وارد ﳕودن پلاﲰیدها به Gordonia از الکﱰوپوریﱰ Gene pulser X-Cell - BioRad - استفاده شد . سلوﳍاي Electrocompetent با استفاده از روش Steinbuchel ﲥیه شد. 200 μl سلول مستعد در داخل الکﱰوآووت 0.2-gap با پلاﲰید ﳐلوط شده و به مدت 5 دقیقه بر روي یخ قرار داده شد و سپس پالس الکﱰیکی با تنظیمات زیر داده شد : 1.5 kV، 400 Ω و .25 µF بلافاصله پس از الکﱰوپوریشن سلوﳍا با 800 μl ﳏیط LB رقیق شده و به مدت 3 ساعت در30˚ C قرار داده شدند و پس از آن در ﳏیطهاي جامد با آنﱵ بیوتیک مناسب آشت شدند . - 4 - اندازه گﲑي فعالیت گوگردزدایی: براي سنجش فعالیت گوگردزدایی از تست گیبس - Gibb’s Assay - و HPLC جهت تشخیص و اندازه گﲑي - 2 هیدروآسی بی فنیل - - 2-HBP، فرآورده هنایی گوگردزداییDBT، استفاده شد.
نتایج و ﲝث:
باکﱰي Gordonia alkanivorans RIPI90A قادر به حذف گوگرد از ترکیب مدل دي بنزوتیوفن است. در این مطالعه ژهناي dszABC این باکﱰي در یک ساختار نوترکیب، ﲢت کنﱰل پروموتر Plac قرار داده شدند تا بیان ژهناي گوگردزدا افزایش یافته و مهار آهنا توسط سولفات، حذف گردد. بدین منظور دو قطعه 2.5 و 1.3 کیلوبازي حاوي ژهناي dszAB و dszC به طور جداگانه بوسیله PCR تکثﲑ گردیدند و در هنایت با قرار دادن آهنا در پایﲔ دست پروموتر Plac اپرون مهندسی شده dsz در پلاﲰید pRSG43-L2dszABC ساخته شد. این پلاﲰید با روش الکﱰوپوریشن به باکﱰي Electrocompetent منتقل شده و سویه نوترکیب RIPI90A بدست آمد. این سویه نوترکیب که حامل پلاﲰید نوترکیب pRSG43-L2dszABC بود به ﳘراه سویه وحشی، به عنوان شاهد، در ﳏیط کشت پایه معدنی حاوي سولفات و کازآمینواسید کشت داده شد.
در فواصل زمانی 3 ساعته ﳕونه برداري اﳒام گرفت و منحﲏ رشد باکﱰي - OD660 - و منحﲏ فعالیت گوگردزدایی - میزان 2-HBP تولیدي - رسم شد. شکل 1 منحﲏ رشد و فعالیت گوگردزدایی سویه نوترکیب و سویه شاهد را نشان می دهد. در این شکل سویه شاهد در ﳏیط فاقد سولفات و کازآمینو اسید و داراي DBT به عنوان تنها منبع گوگرد رشد داده شده است. سویه شاهد در حضور سولفات و کازآمینواسید کاملا فاقد فعالیت گوگردزدایی بود. مقایسه منحﲏ رشد و فعالیت گوگردزدایی سویه نوترآیب با سویه وحشی نشان می دهد آه علاوه بر آاهش قابل توجه مدت زمان رشد سویه نوترآیب، به علت امکان استفاده از ﳏیطهاي آشت غﲏ شده، فعالیت گوگردزدایی آن نیز در مقایسه با سویه وحشی به میزان قابل توجهی افزایش یافته است. به منظور تایید گوگردزدایی از DBT و اندازه گﲑي آمی -2هیدروآسی بی فنیل مقدار 4 میلی لیﱰ از هر ﳕونه نیز استخراج حلاﱄ شده و بوسیله HPLC مورد آنالیز قرار گرفت. نتایج حاصل از HPLC نیز موید ﲠبود فعالیت گوگردزدایی در سویه نوترکیب است. به نظر می رسد که با بدست آوردن این سویه نوترکیب ﲞشی از مشکلات اساسی تبدیل BDS به فرآیند ﲡاري برطرف شده است. ساخت وکتورهاي بیانی جدید با استفاده از پروموترهاي اختصاصی جنس Gordonia می تواند به افزایش هر چه بیشﱰ بیان ژهناي گوگردزدا و ﲠبود بیوکاتالیست منجر گردد
