بخشی از مقاله
چکیده مقدمه:
پوسته برنج، جزء ضایعات کشاورزي است که به مقدار زیاد و ارزان بویژه در شمال کشور در دسترس می باشد. هدف از این مطالعه بررسی امکان استفاده از پوسته برنج براي تولید گلوکز با استفاده از سویه قارچی تریکودرما ریسئی به روش تخمیر در بستر جامد می باشد. مواد و روشها:سوش قارچیTrichoderma reesei لیوفیلیزه به شمارهPTCC5142 ابتدا به محیط کشت مایع و سپس به محیط کشت جامد بصورت اسلنت منقل شد. براي نگهداري سوش از محیطM.E.A در دماي 4 c استفاده شد. بعد از آماده سازي سوبسترا و محیط پیش کشت، محیط کشت اصلی تهیه شد. با تهیه محلول خام آنزیمی، مقادیر غلظت گلوکز، پروتئین، فعالیت کاغذ صافی و آنزیم اندوگلوکاناز با استفاده از سوبستراي کربوکسی متیل سلولز اندازه گیري و شرایط بهینه محیط کشت در تولید گلوکز به روش SSF بررسی شد.
مقایسه میزان گلوکز تولید شده در گروه هاي کشت، تحت شرایط مختلف انکوباسیون زمانی و دمایی، با استفاده ازآزمون ANOVA انجام شد و P<0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج:کشت Trichoderma reesei بر روي سوبستراي پوسته برنج پس از گذشت چهار روز به حداکثر رشد خود و فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز و کاغذ صافی نیز به بالاترین حد خود رسید. و پس از آن کاهش یافت. بیشترین میزان تولید گلوکز نیز بعد از 4 روز - - P<0.01 و در دماي - P<0.05 - 30 c بدست آمد. نتیجه گیري:یافته هاي مطالعه نشان داد که سویه قارچی تریکودرما ریسئی براي هیدرولیز آنزیمی پوسته برنج و تولید گلوکز به روش تخمیر در بستر جامد مناسب میباشد.
کلمات کلیدي:گلوکز، پوسته برنج، تخمیر در بستر جامد، تریکودرما ریسئی
مقدمه
سوبستراهاي لیگنو سلولوزي از جمله پوسته برنج، جزء ضایعات کشاورزي و فراورده جانبی کارخانجات شالیکوبی میباشند که هم میتوانند در جهت مصرف خوراك دام و طیور مورد استفاده قرار گیرند و هم اینکه در جهت تولید برخی دیگر از متابولیتهاي میکروبی مانند آنزیمهاي سلولیتیک و یا اتانول بکار روند . - 1-4 - مطالعاتی نیز در در سالهاي اخیر به منظور افزایش ارزش غذایی پوسته برنج در برخی از کشورها انجام گرفته است. در مطالعه انجام شده در سال 2007 میلادي در نیجریه، نشان داده شد که تخمیر پوسته برنج با استفاده از قارچ تریکودرما ویریدي به مدت 40 روز می تواند باعث افزایش معنی دار در مقدار پروتئین خام، محتوي انرژي و مواد معدنی چون سدیم و پتاسیم گردد و همچنین مقدار فیبر خام را کاهش دهد - . - 5 در گزارش Zaid و همکارش در سال 2009 نیز میزان پروتئین خام در پوسته برنج تخمیر شده 97 درصد افزایش یافته و میزان فیبر خام 45 درصد کاهش داشته است . - 6 - در پروسه تخمیر پوسته برنج، میتوان از روش تخمیر در بستر جامد 1 - SSF - و همچنین تخمیر در بستر مایع یا کشت غوطهور 2 - SMF - بهره جست که هر کدام از آنها بسته به نوع روش مزایا و معایبی دارند. 7 - و . - 8هدف از این مطالعه، بهینهسازي محیط کشت رشد قارچ تریکودرما ریسئی و تولید گلوکز از طریق هیدرولیز آنزیمی ضایعات لیگنوسلولوزي به روش تخمیر در بستر جامد می باشد.
مواد و روشها:
براي انجام این مطالعه آزمایشگاهی، سوش قارچی Trichoderma reese به شماره PTCC5142 از سازمان پژوهش هاي علمی صنعتی ایران بصورت آمپول لیوفیلیزه خریداري شد و در زیر هود استریل، عملیات باز کردن آمپول و انتقال آن به سرم فیزیولوژي انجام گردید و سپس به منظور نگهداري طولانی مدت سوش در محیط کشت شیبدار M.E.A - Malt.extract.Agar - ، کشت داده و در دماي 4 درجه سانتی گراد نگهداري شد. سوبستراي بکار گرفته شده در این مطالعه، پوسته برنج بوده که بعنوان منبع کربن مورد استفاده قرار گرفت. سپس مراحل آماده سازي سوبسترا و تهیه محیط پیش کشت و محیط کشت تخمیري انجام گردید.
تهیه محیط کشت اصلی: پس از اتوکلاو نمودن فلاسکها و خنک شدن در دماي محیط در شرایط املاًک استریل، تلقیح از پیش کشت به محیط کشت اصلی انجام شد. به این ترتیب که با لوپ استریل تکهاي از کلنیهاي قارچ رشد یافته بر روي بستر جامد، به فلاسک محتوي محیط کشت اصلی انتقال داده شد و زیر و رو گردید و این عمل سه الی چهار بار تکرار شد تا حدود 5 درصد کلنیهاي قارچ رشد یافته منتقل گردید و سپس با تهیه سوسپانسیون قارچی با سرم فیزیولوژي، مقدار 10 میکرولیتر از این سوسپانسیون را بین لام و لامل نئوبارقرار داده و با استفاده از میکروسکوپ نوري، تعداد اسپورهاي قارچی در هر یک از مربع ها شمارش شد و با اعمال ضریب رقت که بستگی به حجم سرم فیزیولوژي مورد استفاده داشت؛ تعداد کل اسپورها محاسبه گردید و زمانی که تعداد اسپورهاي روي محیط کشت اصلی به 8 105 Wet Weight 1 رسید؛
مجدداًکالچرها در انکوباتور 30 0C بمدت 5 الی 7 روز گرمخانه گذاري شدند. پس از اتمام مدت زمان لازم محیطها از انکوباتور خارج گردیدند. روش جداسازي محلول آنزیمی و اندازهگیري غلظت گلوکز، پروتئین و فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز : ابتدا بافر سیترات در pH= 4/8 تهیه گردید و سپس 5 برابر وزن سوبستراي جامد، به فلاسکها بافر سیترات اضافه شد - . - 5×12/5=125ml سپس فلاسکها برروي شیکر با دور بالا بمدت 15 دقیقه قرار داده شدند تا محتویات املاًکیکنواخت شده و بعد از روي کاغذ صافی واتمن شماره 1 عبور داده شدند. جهت اطمینان یافتن از عدم حضور اسپور قارچ، محلول زیر صافی، در دماي 4 c با دور 4000rpm بمدت 20 دقیقه سانتریفوژ گردید. این عمل سبب شد که در طول انجام آزمایشات کدورت ایجاد نشود. جهت اندازهگیري غلظت گلوکز محلول خام آنزیمی از کیت گلوکز اکسیداز - از تولیدات شرکت من - که یک روش آنزیمی سنجش قند است استفاده شد و میزان پروتئین نیز به روش لوري انجام شد. جذب نمونهها در طول موج 578 نانومتر قرائت شد و با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوي - BSA - ، غلظت پروتئین در نمونه مجهول بر حسب mg/ml بدست آمد.
اندازه گیري فعالیت اندوگلوکاناز بر اساس محاسبه فعالیت کاغذ صافی می باشد. و میزان فعالیت برحسب - unit/ml - محاسبه شد. بررسی رشد قارچ در دوره هاي زمانی مختلف:عمل بهینه سازي زمان با تهیه 6 محیط کشت انجام گردید. براي این منظور دوره هاي زمانی مختلف 3 - روز تا 8 روز - مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی رشد قارچ درشرایط انکوباسیون دمایی مختلف:به منظور بهینه نمودن دماي نگهداري، با تهیه 5 محیط کشت، دماهاي مختلف 26 - تا 34 درجه سانتی گراد - مورد مطالعه قرار گرفت. آنالیز آماري: براي تجزیه و تحلیل داده ها و مقایسه میزان گلوکز تولید شده در گروه هاي کشت تحت شرایط مختلف انکوباسیون زمانی و همچنین دمایی، از نرم افزار آماري SPSS و آزمون ANOVA استفاده شد و P<0.05 معنی دار در نظر گرفته شد.
یافته ها:
نتایج این مطالعه نشان داد Trichoderma reesei در 6 محیط کشت که در درجه حرارت30 0C طی دوره هاي زمانی مختلف 3 - روز تا 8 روز - در انکوباتور رشد نمودند؛ پس از گذشت 96 ساعت 4 - روز - به حداکثر رشد خود میرسند و کلنیها و اسپورهاي قارچ سرتاسر محیط کشت را میپوشانند. در این فاصله زمانی 4 روز، فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز و همچنین فعالیت کاغذ صافی نیز به بالاترین حد خود میرسد و پس از گذشت چهار روز کاهش مییابد. همچنین غلظت گلوکز تولید شده که به روش آنزیمی گلوکز اکسیداز اندازه گیري شد؛ در روز چهارم به میزان 136/4 میلی گرم در دسی لیتر بیشترین مقدار بوده است که با مقادیر گلوکز در روز سوم و ششم تفاوت معنی داري نداشت ولی نسبت به مقادیر گلوکز تولید شده در روزهاي ینجم و هشتم با P<0.05 اختلاف معنی دار داشت. همچنین با مقدار گلوکز تولید شده در روز هفتم که کمترین مقدار مشاهده شده بود نیز با P<0.01 تفاوت معنی داري را نشان داد - جدول . - 1
با توجه به نتایج آزمایشات مرحله قبلی که بیشترین فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز و همچنین فعالیت کاغذ صافی بعد از 4 روز کامل مشاهده شد؛ در مرحله دیگر مطالعه بر روي قارچ تریکودرما ریسئی که در 5 محیط کشت حاوي پوسته برنج به مدت 4 روز در دماهاي 26، 28، 30، 32 و 34 درجه سانتی گراد در انکوباتور صورت گرفت؛ نشان داد شد که در محلول خام آنزیمی تهیه شده از این محیط هاي کشت، میزان گلوکز تولید شده در دماي103 - 30 0C میلی گرم در دسی لیتر - بیشترین مقدار می باشد که با مقادیر گلوکز در دماهاي 26 و 34 درجه سانتی گراد تفاوت معنی داري نداشت ولی نسبت به میزان گلوکز در دماهاي 28 و 32 درجه بطور معنی داري بیشتر بود . - P<0.05 - کمترین مقدار گلوکز تولید شده نیز در دماي32 0C به مقدار 58 میلی گرم در دسی لیتر بدست آمد - جدول . - 2
