بخشی از مقاله
چکیده
جنس Gordonia بدلیل تواﳕندیهاي گسﱰده آنزﳝی از جنبه هاي ﳐتلف مورد توجه فراوان است، اما ﲠره برداري از این پتانسیل در زمینه هاي ﳐتلف بیوتکنولوژي بدلیل فقدان ابزارهاي دستورزي ژنتیکی، تاکنون میسر نگردیده است. در این مطالعه ناحیه پروموتري اپرون dsz باکﱰي Gordonia alkanivorans RIPI-90A با استفاده از تواﱄ شناخته شده ژهناي dsz جداسازي گردید. کتاﲞانه هاي Adaptor-ligated با هضم DNA ژنومی بوسیله آنزﳝهاي ﳏدودکننده PstI و EcoRI و سپس اتصال آداپتورهاي اختصاصی، ساخته شدند. براي قدم زدن از تواﱄ شناخته شده، کتاﲞانه هاي ﲥیه شده بوسیله پراﳝرهاي اختصاصی ژن و اختصاصی آداپتور، PCR شدند.
PCR دوم با استفاده از یک پراﳝر اختصاصی ژن داخلی اﳒام شده و ﳏصولات PCR بر روي ژل آگارز جداسازي و قطعات مناسب با PCR کنﱰل اختصاصی ژن شناسایی گردیدند. دو قطعه 300 و 500 bp بدین ترتیبانتخاب و تعیﲔ تواﱄ شدند.بررسی شباهت تواﱄ با رکوردهاي بانک ژنی بوسیلهبرنامه BLAST نشان دادکه تواﱄ بدست آمده با ناحیه بالادست اپرون dsz باکﱰيGordonia alkanivorans strain 1B وﳘچنﲔ یکترانسپوزاز فرضی از باکﱰي Gordonia sp. CYKS2%98 شباهت دارد. مطالعات بیشﱰ براي تعیﲔ ویژگیهاي پروموتر بدست آمده در حال اﳒام است.
کلمات کلیدي: گوردونیا، گوگردزدایی بیولوژیک، پروموتر، Genome Walking
مقدمه
جنس Gordonia که به خانواده اکتینومایست ها تعلق دارد در ساﳍاي اخﲑ به دلایل گوناگون مورد توجه فراوان قرار گرفته است. اغلب گونه هاي این جنس به دلیل توانایی آهنا در ﲡزیه ترکیبات آلاینده ﳏیطی یا پلیمرهایی که در شرایط طبیعی به کندي ﲡزیه می شوند، شناسایی شده اند. ﲡزیه، تبدیل یا سنتز ترکیبات شیمیایی بسیار متنوع توسط این جنس سبب شده که این باکﱰي ها در بیوتکنولوژي ﳏیطی و صنعﱵ از اﳘیت فراوانی برخوردار گردند، بطوري که مقالات و پتنت هاي مرتبط با آهنا به صورت روز افزون در حال افزایش است. توانایی تبدیل ترکیبات هﱰوسیکلیک می تواند در فرآیند هاي مهم صنعﱵ از ﲨله پالایش سوخت هاي فسیلی، مورد استفاده قرار گﲑد.
وجود هﱰواﰎ هاي گوگرد در این سوخت ها سبب اﳚاد مسائل زیست ﳏیطی گسﱰده می شود که از مهمﱰین آهنا می توان به تولید باراهناي اسیدي اشاره ﳕود . - 1 - آنزﳝهاي مسﲑ بیوشیمیایی حذف گوگرد از ترکیب مدل دي بنزوتیوفن - DBT - در باکﱰیهاي گوگردزدا بوسیله اپرون dsz کدگذاري می شوند کهسه ژن dszA، dszB و dszC را شامل می شود و هر سه ژن توسط پروموترمشﱰک dsz رونویسی می شوند. تواﱄ ژهناي dszABCبراي ﳔستﲔ باردرباکﱰي R.erythropolis IGTS8 تعیﲔ گردید وپس از آن در باکﱰي هاي
گوگردزداي ﳐتلف از ﲨله گونه هاي جنس Gordonia نیز مورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد که شباهت فراوانی بﲔ این توالیها وجود دارد . - 2 -
علی رغم آنکه تواﱄ ژهناي گوگردزداي dszABC در باکﱰي هاي زیادي از ﲨله سویه Gordonia alkanivorans RIPI90A مورد بررسی قرار گرفته است اما تاکنون گزارشی در خصوص تعیﲔ تواﱄ ناحیه پروموتري اپرون dsz در جنس Gordonia ارائه نشده است. مطالعه پروموتر dsz در سویه RIPI90A علاوه بر آنکه به شناخت ساختار ژنتیکی و کنﱰل بیان ژن در جنس Gordonia کمک می کند، سبب خواهد شد که در آینده بتوان از اپروهناي مهندسی شده، براي افزایش بیان فعالیت گوگردزدایی نیز استفاده ﳕود. در این مطالعه ناحیه پروموتري اپرون dsz در باکﱰي Gordonia alkanivorans RIPI90A با استفاده از روش Adaptor Mediated PCR-walking جداسازي و تعیﲔ تواﱄ گردیده است.
مواد و روشها
استخراج DNA ژنومی و هضم آنزﳝی: DNA ژنومی باکﱰي Gordonia با استفاده از روش Steinbuchel استخراج گردید. مقدار 5 ʽg از DNA ژنومی با دو آنزﱘ ﳏدود کننده EcoRI و PstI به مدت سه ساعت در C ْ37 هضم گردید. براي توقف فعالیت آنزﱘ ﳏدود کننده از ﳏلول 1:1 فنل-کلروفرم استفاده شد.طراحی پراﳝر و آداپتور: با توجه به اینکه دو آنزﱘ ﳏدود کننده EcoRI و PstI فاقد ﳏل برش در 400 نوکلئوتید ابتداي ژن dszA، که ﳎاور پروموتر dsz است، بودند از این دو آنزﱘ براي برش دادن ژنوم استفاده شد و آداپتورها نیز بر اساس تواﱄ ﳏل برش این دو آنزﱘ طراحی گردید . - 3 - طراحی پراﳝرها به ﳓوي اﳒام شد که به ﳘراه ناحیه پروموتري، 100bp از ژن dszA نیز تکثﲑ شود. جدول 1 تواﱄ پراﳝرها و آداپتورهاي مورد استفاده را نشان می دهد.
ﲥیه :Walking library ﳔست دو رشته آداپتور با کاهش تدرﳚی دما از 70 درجه به 37، 25 و 4 درجه با فواصل زمانی 10 دقیقه در دستگاه PCR به یکدیگر متصل شدند. 10ʽl از DNA ژنومی هضم شده با 2ʽl از آداپتور مربوطه ﳐلوط شده و به مدت یک شب در دماي C ْ16 عمل ligation اﳒام گرفت - حجم هنایی واکنش . - 30ʽl پس از پایان واکنش و غﲑفعال ﳕودن آنزﱘ لیگاز، 70ʽl آب مقطر به واکنش فوق افزوده شده و از آن به عنوان الگو در PCR استفاده شد . - 4 - واکنش PCR و جداسازي قطعات پروموتري: جهت جداسازي ناحیه پروموتري براي هر یک از Walking library هاي ﲥیه شده با دو آنزﱘ، واکنش PCR با پراﳝر رفت اختصاصی آداپتور و پراﳝر برگشت اختصاصی ژن اﳒام گرفت. PCR دوم با استفاده از پراﳝر اختصاصی ژن داخلی اﳒام شد و قطعات حاصل از PCR بر روي ژل آگارز جدا شده و باندهاي مربوطه خالص گردید و براي اطمینان از صحت آهنا، PCR تاییدي با دو پراﳝر اختصاصی ژنdsz-F - و - dsz-R اﳒام گرفت.
نتایج و ﲝث
جنس Gordonia به دلیل طیف گسﱰده واکنش هاي آنزﳝی که توسط اعضاي آن کاتالیز می شود از اﳘیت فوق العاده اي در بیوتکنولوژي برخوردار است. دانش اندک در خصوص ژنتیک این جنس و کمبود ابزارهاي دستورزي ژنتیکی از ﲨله عوامل ﳏدودکنننده کاربرد آهنا ﳏسوب می گردد. در این مطالعه از روش PCR-Walking براي جداسازي ناحیه پروموتري اپرون dsz که در ﳎاورت تواﱄ شناخته شده ژن dszA قرار گرفته، استفاده شد.از دو آنزﱘ ﳏدودکننده EcoRI و PstI براي هضم ژنوم و ﲥیه Walking library استفاده شد. PCR اولیه با استفاده از پراﳝرهاي gene specific و adaptor specific به علت غﲑ اختصاصی بودن پراﳝر دوم تعداد زیادي باند غﲑاختصاصی نیز تکثﲑ می ﳕود که تعداد زیادي از آهنا با استفاده از پراﳝر اختصاصی ژن داخلی - Nested - ، حذف گردید.براي مشخص ﳕودن قطعات حاوي ناحیه پروموتري، PCR تاییدي با استفاده از دو پراﳝر رفت و برگشت gene specific بر روي باندهاي خالص شده، اﳒام گرفت و در هنایت دوقطعه 300 و 500 نوکلئوتیدي که به ترتیب P1 و P2 نامیده شدند به عنوان باندهایی که احتمالا حاوي ﲞش پروموتري اپرون dsz هستند،انتخاب شدند.
شکل 1 قطعات P1 و P2 را که بر روي ژل آگارز خالص شده اند نشان می دهد.تعیﲔ تواﱄ دو قطعه P1 و P2 نشان داد که این قطعات علاوه بر ﲞش 100 نوکلئوتیدي ابتداي ژن dszA، ناحیه بالادست این ژن، پروموتر dsz، را نیز در بر دارند. Alingment تواﱄ پروموتر dsz در باکﱰي RIPI90A با توالیهاي بانک ژنی با استفاده از برنامه BLAST نشان داد که ناحیه بدست آمده با ناحیه بالادست اپرون dsz در باکﱰي G.alkanivorans strain 1B و ﳘچنﲔ یک ترانسپوزاز فرضی در باکﱰي Gordonia sp. CYKS2 شباهت 98 درصدي دارد. وجود این ترانسپوزاز در ﳎاورت اپرون dsz جنس هاي گوگردزداي دیگري ﳘچون Rhodococcus نیز گزارش شده است و به نظر می رسد عامل انتقال این ژهنا در بﲔ باکﱰي ها ﳐتلف باشد. به منظور تعیﲔ Minimal promoter sequence و مشخص ﳕودن ﲞشی از تواﱄ پروموتر که در مهار ژهناي dsz بوسیله سولفات و سایر منابع گوگرد سهل الوصول نقش دارد، مطالعه - Deletion Analysis - بر روي تواﱄ بدست آمده با استفاده ژن گزارشگر لوسیفراز ادامه دارد.
