بخشی از مقاله
تعريف عیار پروتئين
اسيدينه ای را که در واکنش فوق ظاهر ميگردد ميتوان در مجاورت فنل فتالئين با سود تيتره نموده و از روی عبارت پروتئين به نسبت درصد پروتئينهای موجود در شير پی برد. عيار پروتئين که به (Eiweisstiter=Et) نشان داده ميشود عبارتست از تعداد ميلي ليترهای سود که برای 25 ميلي ليتر شير لازم است تا پس از اضافه کردن فرمالدئيد در مجاورت فنل فتالئين رنگ استاندارد بدست آيد عيار پروتئين در شيرهای تازه نسبت درصد مقدار پروتئين را نشان ميدهد.
وسائل لازم برای آزمايش:
- يک بورت مدرج (تا 01/0 ميلي ليتر).
- 2بشر 250تا 400 ميلي ليتری
- يک پيپت 25 ميلي ليتری.
- يک پيپت 5/0 ميلي ليتری
درصورت امکان می توان از دستگاه سنجش پروتئينهای شير ساخت ژربر استفاده نمود. اين دستگاه شامل بورتيست که ستون مدرج آن نسبت درصد پروتئينها را مستقيماً در 25 ميلي ليتر
معرف های لازم برای آزمايش:
1- محلول سود (n143/0) عاری از
2- محلول الکلی فنل فتالئين(2گرم فنل فتالئين را با الکل 96 درجه به 100 ميلي ليتر ميرسانيم).
3- محلول اکسالات دو پتاس (28 گرم اکسالات دوپتاس خنثی را با آب مقطر به 100 ميلي ليتر ميرسانيم).
4- محلول تجارتی فرمالين 40 درصد
5- محلول سولفات دوکوبالت (25 گرم سولفات دوکوبالت را با آب مقطر به 100 ميلي ليتر ميرسانيم).
در صورت امکان ميتوان از معرفهای آماده ساخت ژربر که برای 200 آزمايش کافيست استفاده نمود.
مشخصات نمونه مورد آزمايش:
شير مورد آزمايش نبايد حاوی مواد نگهدارنده مانند بی کرمات دوپتاس يا فرمل باشد نمونه را قبل از آزمايش بحرارت 20 درجه سانتيگراد رسانده و بدون اينکه کف کند خوب بهم ميزنيم.
طرز عمل:
الف)تهيه رنگ استاندارد:
در يکی از بشرها 25 ميلي ليتر شير, يک ميلي ليتر از محلول اکسالات دوپتاس و 5/0 ميلي ليتر از محلول 5 درصد سولفات کوبالت ميريزيم رنگ استاندارد بايد هر ساعت يکمرتبه تعويض گردد.
ب)تيتراسيون:
در بشر ديگر 25 ميلي ليتر شير, يک ميلي ليتر از محلول اکسالات دوپتاس و 25/0 ميلي ليتر فنل فتالئين ريخته و پس از اينکه بهم زديم با سود تيتره مينماييم و با رنگ استاندارد مقايسه مي کنيم. سپس 5 ميلي ليتر از فرمالين 40درصد اضافه نموده و پس از لااقل يک دقيقه تا بدست آمدن رنگ گلی مشابه استاندارد باسود تيتره مينماييم. ميلي لژترهای سود مصرف شده عيار پروتئين شير را نشان ميدهد.
دقت آزمايش:
اين آزمايش تا03/0 درصد پروتئين را نشان مي دهد. آزمايش فوق العاده سريع بوده و در مورد تعداد زياد نمونه چنانچه با يکدستگاه 2 نفر کار کنند هر آزمايش بيش از 2 دقيقه بطول نخواهد انجاميد.
روش تيتراسيون فرمل در عمل بيشتر برای سنجش نسبت درصد پروتئين شيرهای مخلوط و اندازه گيري با زده پنيرسازی مورد استفاده قرار ميگيرد و در مورد شيرهای انفرادی(يا شير يک سر دام) دقت زيادی ندارد.
علل اصلی اشتباه در عمل:
علل اصلی که ممکن است موجب اشتباه در عمل گردند عبارتند از:
1- تغيير عيار سود مثلاً با جذب اتيدريد کربنيک موجود در هوا.
2- استعمال فنل فتالئينی که کاملاً خنثی نباشد.
3- کندی يا سرعت زياد در تيتراسيون.
4- وجود کف در نمونه شير.
5- ترشی شير
روش نصب رنگ:
اهميت و موارد استعمال آزمايش: روش نصب رنگ سريعترين روشی است که در حال حاضر برای سنجش پروتئين های شير تعداد زيادی نمونه (چندين صدتا چند هزار در روز) مورد استفاده قرار ميگيرد. اين روش مخصوص آزمايشگاههای بزرگ و کارخانه هائيست که روزانه مقدار زيادی شير برای تهيه پنير دريافت مينمايند و به منظور پرداخت بهای شير و بهبود توليد شير(از نقطه نظر کميت و کيفيت) بکار ميرود.
اصول آزمايش:
اساس اين روش عبارتست از نصب رنگهای آنيلين بر روی پروتئين ها که ابتدا بوسيله Fraenkel-Conrat و Cooper مطالعه شده و سپس دو شيميدان آلمانی به نامهای Udy , Hetzel , Schober آمريکايي از اين اصل به منظور سنجش پروتئينهای شير استفاده نموده اند.
عاملهای قطبی پروتئينها رنگهايي را که دارای بار الکتريکی مخالف باشند بخود جذب مينمايند. پروتئينهای شير پائين تر از نقطه ايزوالکتريک يا بعبارت ديگر در سمت اسيدی اين نقطه بار الکتريکی مثبت نشان داده و بعنوان کاتيونها عمل مينمايند. حال درصورتيکه يک ماده رنگی حاوی بار الکتريکی منفی در محلول داخل نماييم با پروتئين تشکيل کمپلکس غير محلولی از پروتئين و رنگ ميدهد. برای اينکه رسوب پروتئين کامل گردد مقدار بيش از اندازه رنگ لازم است. مقدار پروتئين از روی مقدار آزاد رنگ(که بر روی پروتئينها نصب نگرديده است) سنجيده شده و به وسيله اندازه گيری دانسيت
ه اوپتيک مايع باقيمانده اندازه گيری ميشود.
رنگهای مورد استفاده:
رنگهايي که معمولاً در اين روش مورد استفاده قرار ميگيرند عبارتند از:
سياه آميدوB10, Orange G و Acid orange 12 که فرمول ساختمانی آنها بقرار ذيل است:
Amido Black 10B
Orange G
Acid Orange 12
در اروپا آزمايشگاههايي که برای سنجش پروتئينهای شير از روش نصب رنگ استفاده مينمايند سياه آميدوB10 مخصوص الکترو فورز ساخت کارخانه EMerck آلمان را بکار ميبرند سياه اميدو ساخت ساير کارخانه ها نيز در بازاريافت ميشود ولی از نقطه نظر خلوص چندان مطلوب نيست. بهترين نوع سياه آميدو نوعيست که درجه خلوص آن 86 درصد است.
شرائط انجام آزمايش:
نگهداری نمونه ها:
مواد نگهدارنده معمولی مانند بيکرمات دوپتاس يا فرمل برای نگهداری نمونه جهت اين آزمايش مناسب نيستند و در اين مورد بايد از بی کلرور دومرکور استفاده نمود(ولی در استعمال اين ماده بايد احتياط کامل رعايت گردد). نمونه ها را بايد در حرارت 2 تا 4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود.
روشهای آزمايش:
الف)سياه آميدو(طريقه Raadsveld).
وسائل لازم برای آزمايش:
- اسپکتروفوتومتر.
- سرنگ يک ميلي ليتری(Cornwall).
- پيپت 20 ميلی ليتری.
- سانتريفوژ با دور2500 در دقيقه.
در صورت امکان ميتوان از دستگاه Pro –Milk MK II ساخت کمپانی دانمارکیA/S N.
Foss Electric. استفاده نمود با اين دستگاه ميتوان در هر ساعت 50 تا 60 نمونه شير را مورد آزمايش قرار داد.
معرفهای لازم برای آزمايش:
- سياه آميدوB10 مخصوص الکتروفورز ساخت کارخانه E.Merck آلمان
- محلول تامپون 35/2=pH
برای تهيه اين محلول 674/1 گرم (اتيدر) و 371/17 گرم اسيدسيتريک را درآب حل کرده و حجم انرا به يک ليتر ميرسانيم و pH آنرا بدقت در 35/2 تنظيم مينماييم.
- محلول رنگ و تامپون:
44/0 گرم سياه آميدو B10 را بيک ليتر از محلول تامپون سيترات – فسفات اضافه نموده خوب بهمزده و مدت 24 ساعت به حال خود ميگذاريم و سپس آنرا با طول موج با اسپکتروفوتومتر استاندارد مينماييم.
دانسيته اوپتيک اين محلول ( به رقت ) با اسپکتروفوتومتر 68 coleman Junior معادل 005/0 320/0 ميباشد.
طرز عمل:
نمونه های مورد آزمايش را در حرارت آزمايشگاه گرم نموده و چندين مرتبه خوب تکان ميدهيم تا چربی سطحی با شير کاملاً مخلوط گردد.
با سرنگ مخصوص به دقت 5/0 ميلي ليتر از نمونه آزمايش برداشته و در لوله سانتريفورژ وارد مينماييم, سپس با يک پيپت 20 ميلي ليتری معمولی يا خودکاردقيقاً20 ميلي ليتر از محلول رنگ و تامپون بآن اضافه نموده مدت لااقل 30ثانيه بهم ميزنيم تا شير و رنگ کاملاً با يکديگر مخلوط گردندو بعد لوله ها را در داخل سانتريفورژ قرارداده مدت 5 تا 10 دقيقه با دور 2500 در دقيقه سانتريفوژ ميکنيم سپس يک ميلي ليتر از مايع فوقانی داخل لوله سانتريفوژ برداشت نموده با 25 ميلي ليتر آب مقطر رقيق مينماييمو دانسيته اوپتيک آنرا در يک طشتک يک ميلي ليتری با طول موج نسبت به آب مقطر اندازه گيری مينماييم. پس از اينکه رابطه بين دانسيته اوپتيک و مقدار پروتئينها معلوم گرديد, ستون مدرج کلريمتر را ميتوان مستقيماً برحسب گرم پروتئين در کيلوگرم شير مدرج نمود.
ب)Orange – G (طريقه Ashworth )
معرفهای لازم برای آزمايش:
- محلول Orange – G:
برای تهيه اين محلول يک گرم Orange – G , 26 گرم اسيد سيتريک و 5/2 ميلي ليتر از محلول 10درصد تيمول(که برای نگهداری بکار برده ميشود) را در آب حل کرده و حجم آن را به يک ليتر ميرسانيم.
طرز عمل
در يک ارلن مير 50ميلي ليتری شير و 5/2 ميلی ليتر از محلول Orange – G ريخته و دهانه آن را بسته و تقريباً 15 ثانيه تکان ميدهيم سپس مدت نيم ساعت بحال خود گذاشته روی کاغذ صافی صاف ميکنيم و دانسيته اوپتيک مایع صافی را در يکدستگاه اسپکتروفوتومتر با طول موج انداز
ه گيری مينماييم.
تنظيم رابطه بين دانسيته اوپتيک محلول و مقدار پروتئينها:
همانطور که در درجه بندی ستون مدرج چربي سنجهايط که برای اندازه گيری چربی شير بکار برده ميشوند براساس مقايسه با نتايج حاصله از يک روش مرجع مقايسه مثلاً روش رز – گوتليب انجام گرديده است, رابطه بين داتسيته اوپتيک و مقدار پروتئينها نيز باید با استفاده از يک روش مرجع مقايسه ( که در اين مورد روش کيلدال است) و مقايسه نتايج حاصله تنظيم گردد. برای اينکار
بايد مقدار پروتئين تعدادی نمونه شير را (شيرهای انفرادی) به طريقه کيلدال و نصب رنگ تواماً تعيين نمود واز مقايسه آنها جدولی تهيه و در تعبير نتايج حاصله مورد استفاده قرار داد.
محاسبه ظرفيت نصب رنگ:
1) مقدار رنگی را که در مايع فوقانی لوله سانترژفوژ باقی ميماند, ميتوان از رابطه زير برحسب ميلي گرم محاسبه نمود:
مقدار رنگ بر حسب ميلي گرم
که در آن دانسيته اوپتيک محلول رنگ و تامپون, دانسيته اوپتيک مايع فوقانی لوله سانتريفورژ و فاکتور رقت.
2) مقدار پروتئينها بطريقه کيلدال از رابطه زير بدست ميايد:
38/6*(نسبت درصد ازت غير پروتئينی – ازت کلی) = نسبت درصد پروتئينها
نسبت درصد پروتئين*وزن نمونه = مقدار پروتئينها بر حسب گرم.
3) ظرفيت نصب رنگ از رابطه زير بدست ميايد:
= ظرفيت نصب رنگ
مقدار رنگ بر حسب ميلي گرم/مقدار پروتئينها بر حسب گرم=
مقايسه روشهای سياه آميدو و Orange – G:
روش سياه آميدو از روش Orange –G حساس تر است. بعلاوه سياه آميدو با پروتئينها سريعتر واکنش نشان داده و چون دانسيته کمپلکس رنگ و پروتئين حاصله بيشتر است در اثر نيروی گريز از مرکز بهتر و ساده تر برداشته ميشود.
تعيين مقدار کازئين شير(روش استاندارد بين المللی):
موارد استعمال آزمايش:
اين آزمايش بايد در مورد شير تازه انجام شود چنانچه آزمايش شير در فاصله 24 ساعت امکان پذير نباشد, به نسبت 1 در 2500 فرمل به آن اضافه نموده و در جای خنک نگهداری مينماييم.
اصول آزمايش:
منظور از مقدار کازئين شير نسبت درصد وزنی مقدار پروتئين است که بعد از رسوب دادن در 6/4=pH بدست ميآيد. اساس اين ازمايش عبارت از اين است که ابتدا مقدار ازت کلی شير را بطريقه کيلدال تعيين نموده و سپس کازئين را بوسيله يک تامپون اسيد استيک و استات رسوب داده و صاف مينماييم. بعد مقدار ازت کلی مايع صافی را نيز بهمين روش تعيين نموده و مقد
ار کازئين را از روی اين دو سنجش محاسبه مينماييم.
وسائل لازم برای آزمايش(رسوب دادن کازئين):
- پيپت 5/0, 1 و10 ميلی ليتری
- پيمانه استوانه ای مدرج به گنجايش 100 ميلي ليتر.
- بالن ژوژه به گنجايش 100 ميلي ليتر
- کاغذ صافی و قيف
معرفهای لازم برای آزمايش (رسوب دادن کازئين)
- محلول 10درصد اسيد استيک.
- محلول نرمال استات دوسود
طرز عمل:
بطوريکه قبلاً نيز ذکر گرديد, ابتدا مقدار ازت کلی(AT) شير مورد ازمايش را به روش کيلدال تعيين نموده و سپس کازئين را به ترتيب زير رسوب ميدهيم:
با يک پيپت 10 ميلي ليتری 10 ميلي ليتر از نمونه شير را برداشته و در ييک بالن ژوژه 40تا42 درجه سانتی گراد و يک ميلي ليتر از محلول اسيداستيک بآن اضافه نموده محتوی بالن را به ملايمت بهم زده و مدت 10 دقيقه صبر مينماييم سپس يک ميلي ليتر تز محلول استات دوسود به بالن اضافه نموده و مجدداً بهم ميزنيم. محتوی بالن را تقريباً 20 درجه سانتي گراد سرد مينماييم و با آب حجم آن را به 100 ميلي ليتر ميرسانيم و باوارونه کردن بالن انرا خوب تکان ميدهيم وقتی رسوب کازئين و چربی تشکيل گرديد آنرا روی يک صافی که با اسيد شسته شده باشد صاف کرده و مايع صافی را در يک ظرف خشک و تميز دريافت مينماييم کاغذ صافی را يکی دو مرتبه ميشوييم بعد مقدار ازت مايع صافی را روی 50 ميلي ليتر به طريقه کيلدال تعيين مينماييم.
آزمايش شاهد:
علاوه بر آزمايش شاهدی که در مورد سنجش مقدار ازت کلی شير به روش کيلدال ذکر گرديد برای کنترل معرفهای لازم جهت رسوب دادن کازئين نيز بايد با 50ميلي ليتر از محلول اسيداستيک و 5/0 ميلي ليتر از محلول استات دوسود يک ازمايش شاهد انجام داد.
نتيجه گيری:
نسبت درصد وزنی مقدار ازت کلی شير(AT) و ازت موجود در مايع صافی را که به (ANC) نشان داده ميشود محاسبه نموده رقمی را که برای (ANC) بدست ميآيد برحسب حجم رسوب با ضرب کردن در994/0 اصلاح مينماييم و سپس مقدار کازئين را از رابطه زير محاسبه مينماييم
(ANC-AT)38/6
دقت آزمايش:
اشتبه در عمل بين دو سنجش نبايد از 04/0 درصد کازئين تجاوز نمايد.
تعيين مقدار آلبومين:
مايع صافی را که در آزمايش قبلی بدست آمده است با محلول 10 درصد سود دقيقاً خنثی نموده 3/0 ميلي ليتر اسيد استيک يک در ده بآن اضافه کرده و در حمام آب حرارت ميدهيم تا اينکه آلبومين کاملاً رسوب نمايد رسوب را روي يک کاغذ صافی که با اسيد شسته شده باش
د برده با آب سرد ميشوييم و سپس مقدار ازت موجود در آنرا بطريقه کيلدال اندازه گيری مينماييم اگر n مقدار ازت موجود در رسوب باشد مقدار آلبومين از رابطه زير بدست خواهد آمد:
38/6*n =مقدار آلبومين
بنا به عقيده Tapernoux نتيجه حاصله مقدار گلوبولين را نيز نشان ميدهد.
تعيين مقدار ازت غير پروتئينی:
چنانچه مقدار ازت موجود در پروتئيدها را از مقدار ازت کلی شير بکاهيم مقدار ازت غير پروتئينی شير بدست خواهد آمد يا بعبارت ديگر:
(nآلبومين و گلوبولين + Nکازئين) – ازت کلی – ازت غير پروتئيني
