مقاله روش های بررسی فعالیت آنتی اکسیدان های طبیعی موجود در گیاهان دارویی و مواد غذایی

بخشی از مقاله

چکیده:

در سالهای اخیر مطالعات گستردهای در زمینه آنتیاکسیدانهای طبیعی موجود در ترکیبات غذایی صورت گرفته و این موضوع به یکی از پرطرفدارترین زمینههای موجود در قلمرو صنایع غذایی تبدیل شده است. امروزه آزمونهای زیادی جهت بررسی فعالیت آنتیاکسیدانی این ترکیبات به کار گرفته شده که بخش زیادی از آنها بر مبنای روشهای طیف نورسنجی استوار است. بطور کلی این آزمونها به دو دستهی اصلی تقسیم میشوند: - 1 بررسی میزان اکسیداسیون چربیها نظیر آزمون تیوباربیتوریک اسید - TBA - ، بیرنگ شدن -کاروتن، تعیین میزان دی ان های مزدوج. - 2 تعیین مهار شدن الکترونها یا رادیکالها نظیر DPPH، ABTS، FRAP، FOX، FTC، .ACA عموماً توصیه میشود که جهت ارزیابی قدرت آنتی اکسیدانی یک ترکیب، حداقل از دو نوع آزمون مختلف استفاده شود. یکی برای سنجش مرحلهی اول اکسیداسیون چربیها، - آزمونهایی نظیر بیرنگ شدن -کاروتن و سنجش دیانهای مزدوج - و دیگری آزمونهایی که مرحلهی نهایی اکسیداسیون چربیها را مورد ارزیابی قرار میدهند - نظیر آزمون . - TBA

واژه های کلیدی: آنتی اکسیدانهای طبیعی، بیرنگ شدن،   -کاروتن، TBA،.DPPH

مقدمه:

آنتیاکسیدان به عنوان مولکولی تعریف میشود که قادر است اکسیداسیون سایر مولکولها را کاهش دهد یا از آنها جلوگیری کند . - 1 - در حالیکه یک آنتیاکسیدان زیستی - biological antioxidant - ، به عنوان مادهای تعریف میشود که هنگامیکه غلظت کمی از آن، در مقایسه با یک سوبسترای قابل اکسید شدن، موجود باشد موجب یک تاخیر بارز و یا حتی جلوگیری از اکسیداسیون آن سوبسترا خواهد شد . - 2 - این مطلب مشخص و اثبات شده است که اکسیداسیون سبب آسیب رساندن به مواد بیولوژیکی مختلف شده و متعاقب آن، بیماریهای مختلفی را سبب میشود که برخی از این بیماریها عبارتند از: سرطان 3 - - ، بیماریهای کبدی - 4 - ، آلزایمر - 5 - ، پیری - 6 - ، التهاب مفاصل - 6 - ، التهاب - 7 - ، دیابت 9 - و - 10، پارکینسون 11 - و - 12، بیماریهای قلبی و عروقی - 13 - و ایدز . - 14 - بر اساس نتایج، خیلی از این بیماریها از طریق کاربرد آنتیاکسیدانها به منظور جلوگیری از آسیبهای اکسیداتیو، قابل درمان هستند. آنتیاکسیدان-های معروف طبیعی جهت بررسی و مطالعهی امکان استفاده از آنها بهمنظور جلوگیری از این بیماریهای شرحداده شده در بالا، مورد استفاده قرار گرفتند که برخی از این آنتیاکسیدانهای طبیعی عبارتند از:

ویتامین - E -توکوفرول - ، ویتامین C و پلی فنول/فلاونوئیدها . - 15 - همچنین یک گزارش حاکی از آن است که افرادی که تحت درمان با ویتامینE قرار گرفتند - vitamin E therapy - ، در کاهش استرسهای اکسیداتیو و نیز کاهش شکنندگی اسمزی اریتروسیت - erythrocyte osmotic fragility - در بیماران دیالیزی موثر است . - 16 - همچنین نتایج حاصل از یک مقالهی مروری حاکی از این مطلب بود که تحت مصرف ویتامین E قرار گرفتند - - vitamin E theropy، دارای اثرات سودمندی بر بیماران دیابتی است . - 17 - نتایج تحقیقات و بررسیهای بالینی، گواه بر تاثیرات ویتامینC ، بر سرطان و بیماریهای قلبی و عروقی است که این مطلب در مقالهی مروری اخیر مورد بحث قرار گرفته است . - 18 -

در یک تحقیق، مکانیسمهای ممکن برای نقش حفاظتی آنتیاکسیدانها، - شامل فلاونوئیدها، ترکیبات فنولیک و سایر مواد شیمیایی با منبع گیاهی - - phytochemicals، در شراب و سایر غذاهای گیاهی خلاصه شده است . - 21 - اخیراً تحقیقات مرتبط با آنتیاکسیدانهای طبیعی، در زمینههای مختلف، بهطور چشمگیری افزایش داشته است، از جمله در زمینههای: شیمی غذایی، بیولوژی غذایی، شیمی گیاهان طبیعی، گیاهان دارویی و بیوشیمی. برای مثال تعداد زیادی مقاله با موضوع آنتیاکسیدانهای طبیعی در مجلهی agricultural and food chemistry به چاپ رسیده است بهطوریکه 158 مقالهی مرتبط با مطالعات آنتیاکسیدانی، در سال 2008 به چاپ رسیده است. همچنین تعداد زیادی رساله - monograph - و مقالهی مروری - - review دربارهی ارزیابی آزمونهای آنتیاکسیدانی مختلف به چاپ رسیده است . - 25 - 22 - به علاوه مکانیسمهای آنتیاکسیدانها در مهارکردن گونههای اکسیژن فعال - - ROSS، بهخوبی به اثبات رسیده است 26 - و . - 27

بنابراین برای مطالعهی فعالیتهای آنتیاکسیدانی مواد شیمیایی، انتخاب روشها و آزمونهای مناسب بر پایهی نوع مادهی شیمیایی مهم و تعیین-کننده است. اما بهطور کلی دو نوع روش برای سنجش آنتیاکسیدانها موجود است: دستهی اول روشهای شیمیایی معمولی شامل دستگاههای تجزیهای نظیر اسپکتوفوتومتر، کروماتوگراف گازی - GC - ، HPLC، GC/mass اسپکتوفوتومتر، HPLC/mass اسپکتوفوتومتر و دستهی دوم شامل آزمونهای بیولوژیکی است نظیر .ELISA به هر حال تمرکز این مقالهی مروری عمدتاً بر روی روشهای شیمیایی سنجش آنتیاکسیدانها است، زیرا این مقالات مروری ذکر شده در بالا، جزئیات روشهای رنگسنجی - - chromatographic را شرح ندادهاند. همچنین این مقالهی مروری بر روی آزمونهایی که از GC و HPLC استفاده میکنند نیز تمرکز کرده است.

-1 آزمونهای مرتبط با پراکسیداسیون روغنها:

پراکسیداسیون چربیها و محصولات ثانویهی استفاده شده برای آزمونهای اکسیداسیونی: فساد اکسیداتیو لیپیدها - پراکسیداسیون لیپیدها - ، از جنبههای مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. نظیر: نقش آنها در تغییر غذاها، اکسیداسیون حرارتی، اتواکسیداسیون و اکسیداسیون با گونههای اکسیژن فعال - - ROS مکانیسمهای اساسی پراکسیداسیون روغن، میتواند در بسیاری از کتابهای مرجع یافت شود . - 85- 88 - یکی از معروفترین این مکانیسمها در مورد اسیدهای چرب غیر اشباع میباشد. اسیدهای چربی نظیر: لینولئیک، لینولنیک، آراشیدونیک و اسیدهای چرب مختلف خانوادهی امگا . - 89- 92 - 3-شکل1مکانیسمهای پیشنهادی برای پراکسیداسیون چربیها و تولید محصولات ثانویهی عمومی اکسیداسیون را نشان میدهد . - 93 - پراکسیداسیون چربیها با اکسیژن فعال - ROS - آغاز میشود . - 94 - برخی از گونههای معمول فعال اکسیژنی - ROS - ، عبارتند از:

- 1    سوپراکسید - - O°2

- 2    اکسیژن یگانه - - 1O2

- 3    اکسیژن سهگانه - - 3O2

- 4    ازون - - O3

- 5    رادیکال هیدروکسیل - - °OH

- 6    رادیکال آلکوکسیل - - RO°

- 7    رادیکال پراکسیل - - ROO°

بهمحض اینکه این رادیکالها آزاد تشکیل میشوند، پراکسیداسیون چربیها شروع به پیشروی میکند و متعاقب آن محصولات ثانویهی اکسیداسیون مختلف که به اختصار SO نامیده میشوند - مخفف Secondary Oxidation - ، تولید میشوند که این امر در شکل 1 نشان داده شده است. از برخی از این محصولات ثانویهی اکسیداسیون، که از چربیها تشکیل میشوند بهعنوان شاخصهای زیستی - biomarkers - ، در مطالعهی نقش آنها در بیماریهای اشاره شده در بالا استفاده میشود. اگرچه تعداد زیادی از این محصولات حاصل از پراکسیداسیون روغنها شناسایی شدهاند لکن تنها تعداد کمی از این مواد شیمیایی هستند که میتوان از آنها بهطور قابل قبولی بهعنوان    شاخصهای زیستی - biomarkers - در تشخیص آسیبهای اکسیداتیو استفاده کرد. بیشتر آرمون های آنتیاکسیدانی    مرتبط با پراکسیداسیون روغنها مشتمل است بر سنجش و کنترل : - 1 هیدروپراکسیدها  - 2 محصولات ثانویهی اکسیداسیون خاص همچنین مقالههای مروری زیادی وجود دارد که آزمونهای آنتیاکسیدانی مختلف را که مشتمل بر مطالعهی پراکسیداسیون چربیها است، خلاصه
کرده است 96 - 98 - و 24 و . - 23

- 1 آزمون تیوباربیتوریک اسید : - Thiobarbituric Acid Assay - - TBA -

از میان محصولات حاصل از پراکسیداسیون لیپیدها که برای آزمونهای آنتیاکسیدانی مورد استفاده قرار میگیرند، MA - مالون آلدهید - ، بهطور گستردهای جهت برآورد کردن فعالیت آنتیاکسیدانی ترکیبات شیمیایی در سیستمهای پراکسیداسیون روغن، مورد استفاده قرار میگیرد. - 99- 100 - بهویژه اینکه، مالون آلدهید - MA - ، یک شاخص زیستی - Biomarker - مناسب جهت بررسی مرحلهی نهایی پراکسیداسیون روغن است اما بههر حال، آنالیز و تجزیهی مالون آلدهید در نمونههای روغنی بسیار سخت است زیرا از طرفی این ماده در آب بسیار محلول بوده، و از طرف دیگر تمایل دارد که در محلولهای آبی بهصورت پلیمر، حضور داشته باشد.

در اواخر دههی 50، - 1950s - ، بررسی 2 -دزوکسی قندها - 2-deoxy sugars - ، به استفاده از محصول حاصل از ترکیب تیوباربیتوریک اسید و مالون آلدهید - TBA-MA - ، منجر شد. - شکل - 2 که این محصول قابل رویت و تشخیص با روش رنگسنجی در محدودهی ماوراء بنفش و در طول موج nm 535 میباشد. - 101 - اخیراً از این روش با استفاده از دستگاه اسپکتوفوتومتر جهت ارزیابی کارایی و تاثیرات آنتیاکسیدانی روغنهای دارویی - pharmaceutical oils - ، استفاده شده است. - 102 - بنابراین، این آزمون مالون آلدهید -تیوباربیتوریک اسید - MA-TBA assay - به یکی از رایجترین آزمونها برای مطالعات مربوط به پراکسیداسیون چربیها تبدیل شده بود و هنوز هم در حال حاضر از این روش بهطور گستردهای جهت ارزیابی فعالیتهای آنتیاکسیدانی محصولات طبیعی مختلف استفاده میشود.

در یکی از مطالعات مربوط به گیاهان و ترکیبات آنها با استفاده از این آزمون TBA، اخیراً مطالعههایی بر روی عصارههای رزماری، چای سبز، هستهی انگور و گوجه فرنگی صورت گرفته است. - 103 - همچنین در مطالعات دیگری نیز از این روش استفاده شد. 104 - و 105 و 106 و . - 107 بههر حال TBA، با ترکیبات کربونیلی مختلف زیادی که در نتیجهی پراکسیداسیون لیپیدها تشکیل می شوند، قادر به واکنش است که یکی از آنها در شکل2 نشان داده شده است. و این ترکیبات مختلف حاصل از تریکب TBA با گروههای کربوکسیلی، در طول موج ماوراء بنفش، جذبشان، شبیه به جذب MA - TBA میباشد. بنابراین آزمون تیوباربیتوریک اسید - TBA - ، یک آزمون اختصاصی برای تعیین میزان مالون آلدهید - MA - نبوده و نتایج بدست آمده بیش از غلظت مالون آلدهید موجود در محیط میباشد. - 108 - 110 - لذا اخیراً ترکیبات کربونیلی کل قابل واکنش با TBA مطرح شده که به اختصار TBARS نامیده میشود که مخفف TBA Reacting Substances میباشد.

-2 آزمون مالون آلدهید/کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا : - MA/HPLC -
برای    تعیین    مقدار    دقیق مالون آلدهید تشکیل شده از پراکسیداسیون روغن، HPLC به عنوان یک روش اختصاصی برای تجزیه و آنالیز  - MA TBA، قابل    کاربرد    است. به ویژه آنکه استفاده از روش HPLC برای نمونههای زیستی - Biological samples - ، قابل قبول و مناسب است. نمونه- های    نظیر  سرم و    پلاسما در کنار پراکسیداسیون لیپید. . - 111 -  113 - گزارشهای بسیاری در مورد آنالیز قابل قبول MA - TBA به وسیلهی HPLC در نمونههای مختلف به ثبت رسیده است از جمله: در مورد سوسپانسیونهای سلولی و کبد با مشخصات ستون: 25 cm × 4.6 mm C18 - با اندازهی ذرات - 5 P با ویژگی فاز متحرک: آمونیوم استون بافر/متانول با نسبت - 114 - . - 40:60 - و یا در مورد نخاع موش صحرایی، با ویژگی ستون: 15cm ×4.6mm C18 - با اندازهی ذرات - 3 P و با ویژگی فاز متحرک: سدیم استون 10 میلی مولار / متانول با نسبت - 115 - . - 2:1 - و در مورد پلاسمای منی انسان، با ویژگی ستون: 15cm ×4.6mm C18 - با اندازهی ذرات - 5 P و با ویژگی فاز متحرک: بافر پتاسیم فسفات.متانول با نسبت: - 42:58 -