بخشی از مقاله
خلاصه
برای بررسی تشابه میان جدایه های اشریشیاکولای بدست آمده از طیور گوشتی و انسان، حضور دو ژن iss - عامل افزایش مقاومت سرمی و ibeA عامل بروز مننژیت نوزادان - مهم بروز عوارض ناشی از این باکتری در میان 86 جدایه مورد بررسی قرار گرفت. بدین ترتیب که پس از کشت و خالص سازی باکتری اشریشیاکولای از نمونه های مختلف و تائید سویه ها، DNA تام باکتری ها استخراج شده و سپس با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR - و با کمک پرایمرهای اختصاصی عوامل حدت مورد نظر ردیابی شدند.
بر اساس نتایج بدست آمده ژن iss تنها در دو مورد 2/20 - یا - %10 از جدایه های UPEC انسانی و 4/ 40 - 4 یا - %10 مورد از جدایه های مدفوعی طیور گوشتی سالم و در مجموع در %6/97 جدایه های اشریشیا کولای حضور داشت. ژن حدت ibeA تنها در میان یک جدایه عفونت تنفسی طیور 1/10 - یا - %10 و دو 2/40 - یا - %5 جدایه مدفوعی طیور سالم و در مجموع %3/48 جدایه های اشریشیاکولای ردیابی شد. نتایج مطالعه حاضر نشان می دهد که جدایه های طیور اشریشیاکولای می توانند خطر بالقوه و قابل توجهی در بروز عفونت های انسانی این باکتری و بخصوص مننژیت نوزادان باشند.
کلمات کلیدی: اشریشیا کولای، عوامل حدت، PCR
مقدمه
باکتری اشریشیاکولای مهمترین عامل بروز اسهال کودکان و سبب بسیاری از مشکلات عمده بهداشتی در میان کشورهای در حال توسعه است. اشریشیاکولای بیماریزای خارج روده ای یا ExPEC گروه خاصی از اشریشیاکولای است که سبب طیف متفاوتی از عفونت های تهاجمی در انسان و حیوانات میشود. از آن جمله میتوان به مننژیت نوزادان، سپتی سمی، عفونت های دستگاه ادراری و پنومونی در انسان و عفونتهای ادراری در سگ و گربه، سپتی سمی در گوساله ها و کلی باسیلوز سیستمیک در پرندگان اشاره کرد. از میان عفونت های خارج روده ای معمول در انسان که توسط ExPEC بروز پیدا میکند عفونت های دستگاه ادراری یا UTIs اهمیت ویژه ای دارند و اشریشیاکولای عامل این عفونت تحت عنوان UroPathogenic E. coli یا UPEC خوانده میشود.
مشخص شده است که دسته دیگری از این باکتری که در پرندگان سبب بروز بیماری می شود و تحت عنوان Avian Pathogenic E. coli یا APEC نام دارد با بروز UTI در انسان مرتبط است و احتمالا این دو نوع پاتوتایپ قرابت های ژنتیکی را خواهند داشت. مطالعات نشان میدهند که ژن های مسئول حدت که در جزایر بیماریزایی یا Pathogenicity Islands و یا بر روی پلاسمیدهای سویه های APEC وجود دارند نظیرشان در جزایر بیماریزایی و پلاسمید های سویه های UPEC نیز موجود است.
با این وجود بسیاری از عوامل حدت این سویه ها هنوز بخوبی مطالعه و مشخص نشده است. با توجه به توانایی باکتری اشریشیاکولای در کسب افقی یا Horizontal acquisition بسیاری از عوامل حدت و امکان انتقال پلاسمیدهای وابسته به حدت بین سویه های APEC و UPEC بررسی مولکولی حضور ژن های مشترک عامل حدت بخصوص با منشا پلاسمیدی اهمیت بسیار زیادی خواهد داشت.هدف از مطالعه حاضر بررسی و ردیابی حضور ژن حدت iss مسئول مقاومت سرمی سویه های اشریشیاکولای و ژن ibeA مسئول عبور از سد خونی-مغزی - در مننژیت نوزادان ناشی از اشریشیاکولای - در سویه های اشریشیاکولای انسان و طیور پرورشی می باشد.
نمونه گیری و سویه های مورد مطالعه
این مطالعه بر روی 86 جدایه باکتری اشریشیاکولای بدست آمده از طیور گوشتی و انسان انجام شد. نمونه های انسانی مربوط به عفونت ادراری انسان 20 - جدایه - و عفونت گوارشی یا اسهال انسان 6 - جدایه - از بیمارستان امام علی - ع - شهرستان آمل تهیه شد. همچنین جدایه های مربوط به طیور گوشتی شامل جدایه های مدفوعی طیور گوشتی بدون علامت بالینی 40 - جدایه - ، جدایه های کولی باسیلوز پرندگان 10 - جدایه - و جدایه های مربوط به عفونت تنفسی طیور گوشتی 10 - جدایه - در دانشکده دامپزشکی دانشگاه تخصصی فناوریهای نوین آمل از مدفوع طیور گوشتی استان مازندران جدا شد. تمام نمونه های بدست آمده از انسان و سپس نمونه های طیور گوشتی در فاصله زمانی آبان ماه تا بهمن ماه سال 1395 بدست آمدند.
جدایه ها پس از جداسازی و تائید اولیه با کشت بر روی محیط ائوزین متیلن بلو و محیط آگار خوندار، با استفاده از تست های کاتالاز و اکسیداز، رنگ آمیزی گرم و سایر آزمون های بیوشیمیایی شامل تست های اندول MR,VP، و سیترات مورد تائید قرار گرفتند . جدایه های تائید شده تا زمان انجام آزمون های دیگر با استفاده از محیط کشت آبگوشت مغذی و گلیسرول به میزان 20 درصد درون فریزر با دمای 20 درجه نگهداری شدند.
استخراج DNA و آزمون واکنش زنجیرهای پلیمراز - PCR -
قبل از انجام آزمون PCR برای شناسایی و ردیابی ژنهای حدت ibeA - و - iss در این مطالعه ابتدا استخراج DNA از کشت خالص هر کدام از جدایه ها انجام شد. در این پژوهش از روش جوشاندن جهت استخراج DNA نمونه های باکتریایی استفاده شد .در این روش ابتدا درون هر کدام از میکروتیوب های استریل حدود 1/5 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته و سپس 2 لوپ پر از کشت خالص باکتری را برداشته و در آن حل کردیم. در مرحله بعدی به کمک عمل ورتکس سوسپانسیون حاصل را یکنواخت نمودیم.
سپس سوسپانسیون فوق را به مدت 10 دقیقه درون بن ماری در دمای بیش از 95 درجه سانتی گراد انکوبه کرده تا سلول های باکتریایی لیز گردد و DNA آن ها آزاد شود. در ادامه میکروتیوب های حاوی سوسپانسیون را به مدت 10 دقیقه در دور rpm 10000 سانتریفوژ کردیم تا اجزاء ساختمانی پیکره باکتری رسوب کند. سپس مایع رویی حاوی DNA را در درون میکروتیوب های استریل جدید ریختیم. بعد از استخراج DNA و نگهداری آن ها در 20 درجه، روش PCR ساده با کمک پرایمرهای اختصاصی ساخت شرکت تکاپوزیست ایران، جهت بررسی حضور ژن های مورد مطالعه در ژنوم تام استخراج شده از سوش های باکتریایی مورد استفاده قرار گرفت.
