بخشی از مقاله
روش هاي تعيين فعاليت تام آنتي اکسيدان ها
چکيده
اين مقاله مروري بر اهميت و مکانيسم عمل آنتي اکسيدان ها، و همچنين از روش هاي ارزيابي ظرفيت آنتي اکسيداني متمرکز شده است . آنتي اکسيدان ها از طريق رفع راديکال هاي آزاد يا خاموش کردن اکسيژن مولکولي عمل مي کنند، اين شيوه عمل آن ها را قادر به تاخير و يا مهار فرآيندهاي اکسيداسيون که تحت تاثير اکسيژن مولکولي و يا گونه هاي اکسيژن فعال است ، مي سازد. اين گونه هاي اکسيد کننده نگراني هاي فراواني در صنايع مختلف از جمله صنايع غذايي، آرايشي- بهداشتي، دارويي و حتي سلامت افراد و پيشرفت آسيب شناسي آن ها ايجاد نموده اند.
واکنش هاي اکسايشي تنها نگراني صنايع غذايي نيست و آنتي اکسيدان ها به طور گسترده اي براي جلوگيري از تباهي ساير کالاهاي قابل اکسايش مانند مواد آرايشي- بهداشتي، دارويي و پلاستيک ها مورد نياز است . پلي فنول ها مهم ترين ترکيبات گياهي با خواص آنتي اکسيداني هستند. علاوه بر اين ويژگي هاي زيستي ديگري مانند خواص ضدسرطاني، ضدجهش زايي، ضدحساسيتي و ضدپيري براي آنتي اکسيدان هاي طبيعي گزارش شده است .
آنتي اکسيدان ها مسئول مکانيسم دفاع از مواد و ارگانيسم ها در برابر آسيب هاي مربوط به حمله راديکال هاي آزاد بوده و در پيشگيري از آسيب هاي اکسايشي و دژنراتيو آن ها درگير هستند.
به کارگيري و اندازه گيري فعاليت آنتي اکسيداني علاوه بر صنايع غذايي و ساير صنايع استفاده کننده از آنتي اکسيدان ها در بيماري هاي ناشي از استرس اکسيداتيو مانند سرطان ، پارکينسون ، آلزايمر و يا آترواسکلروز نيز اهميت دارند.
روش هاي مختلفي براي ارزيابي ظرفيت آنتي اکسيداني توسعه يافته اند که ، اين روش ها بر اساس با توجه به اصول و اجراي تحليلي تفصيلي در سه دسته عمده تکنيک هاي طيف سنجي، کروماتوگرافي و الکتروشيميايي تقسيم بندي مي شود.
کليدواژگان : آنتي اکسيدان ، پلي فنول ها، ارزيابي ظرفيت آنتي اکسيداني تام
١- مقدمه
کيفيت غذا از نظر مشتري با قابليت پذيرفتن ويژگي هاي ظاهري، عطر و طعم غذا تعريف مي شود. نياز روزافزون به غذاهاي ساده منجر به رشد سريع در زمينه محصولات آماده شده است (هافسترند، ٦٧٧٢). بسياري از ترکيبات غذايي حاوي اسيدهاي چرب غير اشباع بوده که به کاهش کيفيت حساس هستند. به اين دليل ، تلاش ها براي کاهش ميزان اکسيداسيون افزايش يافته که اغلب بهترين راهکار، افزودن آنتي اکسيدان هاست . از سال ١٥٥١، مصرف کنندگان نگراني هاي خود درباره ايمني نگهدارنده ها و افزودني ها در غذا را اظهار داشتند (روخاس و برور، ٦٧٧٢). در سال ١٥٥٥، اسلوآن گزارش کرد که يکي از ده اولويت صنايع غذايي نظارت بر فروش غذاهاي طبيعي، ارگانيک و گياهي است (هيلمن ، ٦٧٧١ و ژوپن ، ٦٧٧١).
در سيستم هاي پيچيده مانند غذاها، مکانيسم هاي مختلفي بر فرآيندهاي اکسايشي تأثيرگذار هستند. اين مکانيسم ها شامل واکنش هاي مولد گونه هاي واکنشگر اکسيژن بوده که ساختارهاي مختلف از قبيل چربي ها، پروتئين ها و کربوهيدرات ها را هدف قرار مي دهد؛ همچنين واکنش هاي فنتون که در آن يون هاي فلزي نقش اصلي را ايفا مي کنند (تروجاکوآ و همکاران ، ٦٧٧٦).
٦- اکسيداسيون
اغلب چربي ها مشکل سازترين اجزاي مواد غذايي در رابطه با اکسيداسيون هستند. محصولات اکسيداسيون اين ترکيبات بر کيفيت ، طعم و بوي ماده غذايي تأثيرات فراواني دارد. هيدروپروکسيدهاي چربي محصولات اوليه اکسيداسيون چربي هستند. آن ها بي مزه و بي بو بوده و با حرارت ، يون هاي فلزي و يا نور، به ترکيبات عامل بو و مزه نامطبوع تجزيه مي شوند.
در اکسيداسيون چربي هاي زنجيره اي از واکنش هاي زنجيره اي روي مي دهد که توسط اکسيژن و گونه هاي واکنشگر آن آغاز مي شود، راديکال هاي آلکوکسي به هيدروژن اسيدهاي چرب غيراشباع حمله نموده و واکنش زنجيره اي را ادامه مي دهند (سرينيواسالن و همکاران ، ٦٧٧٢). راديکال هاي هيدروکسي نيز مي توانند با سيستم هاي کونژوگه واکنش کرده و فرآيند اکسيداسون را ادامه دهند. اين زنجيره اکسيداسيون هنگامي پايان مي يابد که دو گونه راديکال با شکلي از يک گونه غيرراديکال ترکيب شوند.
آنتي اکسيدان ها با دادن اتم هاي هيدروژن به راديکال ها، اين زنجيره را مهار مي کنند.
بيشتر اجزاي غذا مانند کربوهيدرات ها و پروتئين ها طبيعتي غيرراديکال داشته و اغلب با اکسيژن با وضعيت سه گانه (O61) واکنش نمي دهند ولي با اکسيژن يگانه واکنش مي دهند، اين گونه اکسيژن در اثر تغيير دما، کاهش انرژي فعالسازي و حضور فلزات ، مواجهه با پرتوي فرابنفش و آسيب فيزيکي به بافت ايجاد مي شود. اکسيژن يگانه و راديکال هاي آزاد مي توانند موجب آسيب زيستي به درشت مولکول ها و اجزاي غشايي شوند.
اکسيداسيون اسيدهاي چرب مي توانند طيف متنوعي از آلدهيدها، آلکانال ها، آلکن ها و آلکان ها توليد کند که بسياري از آن ها حتي در غلظت هاي بسيار کم نيز بدبو هستند (وگا و برور، ١٥٥٩).
١- روشهاي ارزيابي ظرفيت آنتي اکسيداني تام
روش هاي تحليلي گوناگوني براي ارزيابي توان آنتي اکسيداني توسعه يافته اند که در سه دسته هاي متمايز روش هاي مبتني بر طيف سنجي، روش هاي الکتروشيميايي و کروماتوگرافي تقسيم بندي مي شوند (جياردي و همکاران ، ٦٧١٧).
١-١- تکنيک طيف سنجي
تکنيک طيف سنجي بر واکنش راديکال ، کاتيون يا راديکال هاي پيچيده با يک مولکول آنتي اکسيدان که قادر به دادن اتم هيدروژن بوده ، متکي است .
١-١-١- روش DPPH (١-picrylhydrazyl-٢-diphenyl)
• DPPH (٦، ٦-دي فنيل -١-پيکريل هيدرازيل )، با توجه به عدم استقرار مکاني الکترون اضافي در کل مولکول ، يک راديکال آزاد پايدار است .
بنابراين ، DPPH•، همانند اکثر راديکال هاي آزاد نمي تواند ديمريزه شود. عدم استقرار مکاني در مولکول DPPH • با ظهور رنگ بنفش که باند جذب با حداکثر جذب در حدود nm ٩٦٧ دارد، تعيين مي شود.
هنگامي که DPPH• با دهنده هيدروژن واکنش مي دهند، يک شکل مولکولي احيا شده از DPPH شکل گرفته که با ناپديد شدن رنگ بنفش همراه است .
بنابراين –اهش جذب به طور خطي به غلظت آنتي اکسيدان بستگي دارد. Trolox
به عنوان آنتي اکسيدان استاندارد در اين روش استفاده مي شود (پيسوچي و همکاران ، ٦٧٧٥ و برا ند- ويليا مز و همکاران ، ١٥٥٩).
روش طيف سنجي با DPPH براي تعيين ظرفيت آنتي اکسيداني در عصاره هاي ميوه و آبميوه ها به کار مي رود. منحني استاندارد بين نه و ٢٧٧ ميلي مولار براي Trolox خطي است (پيسوچي و همکاران ، ٦٧٧٥ و تاي پونگ و همکاران ، ٦٧٧٣).
١-١-٦- روش sulfonic acid( ABTS-٦-thiazoline)ethylbenz- -٣)azino-bis-٦٦)
راديکال کاتيون ABTS( ABTS •+) در nm ٠١١ جذب داشته و رنگ سبز متمايل به آبي را داده که در اثر از دست دادن يک الکترون توسط اتم نيتروژن ABTS (٦، ʹ٦- آنيزو- بيس (١-اتيل بنزتيازولين -١- سولفونيک اسيد)) تشکيل مي شود. در حضور Trolox يا آنتي اکسيدان دهنده هيدروژن ديگر، اتم نيتروژن اتم هيدروژن را خاموش کرده و موجب رنگ زدايي محلول مي شود (تاي پونگ و همکاران ، ٦٧٧٣).
ABTS مي تواند توسط پرسولفات پتاسيم يا دي اکسيد منگنز اکسيد شود، افزايش راديکال کاتيون ABTS که با کاهش جذب در nm ٠١١ همراه است ، در حضور Trolox پايش شه و به عنوان آنتي اکسيدان استاندارد انتخاب شده است .
روش طيف سنجي بر اساس کاهش جذب راديکال کاتيون ABTS براي تعيين محتواي آنتي اکسيداني در عصاره هاي ميوه گوآوا، عصاره هاي سبزيجات و ميوه ، آبجوهاي الکي و عاري از الکل ، چاي و قهوه به کار مي روند.
منحني استاندارد بين نه و ١٧٧ ميکرومولار از Trolox خطي بود (تاي پونگ و همکاران ، ٦٧٧٣ و مارک و همکاران ، ٦٧٧١).
١-١-١- روش قدرت آنتي اکسيداني کاهنده آهن (FRAP :Ferric reducing-antioxidant (power
روش FRAP بر احياي مجموعه يون فريک -TPTZ (٦، ١، ٣- تري (٦-پريديل )-١،
١، ٩- تريازين ) توسط آنتي اکسيدان ها متکي است ، اتصال ٢+Fe روي ليگاند رنگ آبي بسيار تيره اي را ايجاد مي کند. جذب مي توان با آزمايش مقدار آهن احيا شده اندازه گيري شود و مي تواند با مقدار آنتي اکسيدان همراه باشد. Trolox و اسيد آسکوربيک به عنوان مرجع استفاده مي شوند.
ظرفيت آنتي اکسيداني تام نکتارها توسط روش FRAP برآورد مي شوند (گيل و همکاران ، ٦٧٧٦ و تاي پونگ و همکاران ، ٦٧٧٣).
١-١-١- سنجش ظرفيت جذب راديکال اکسيژن (Oxygen radical absorbance capacity: ORAC)
روش ORAC توانايي جاروب کنندگي آنتي اکسيداني در برابر راديکال پروکسيل را با القاي ٦، ʹ٦- آزوبيس - (٦-آميدينو- پروپان ) دي هيدروکلرايد (AAPH) در دماي ١٠ درجه سانيتگراد اندازه گيري مي شود.
فلورسئين به عنوان کاوشگر فلورسنت استفاده مي شود. از دست رفتن فلورسنس يک معرف گسترش تجزيه از واکنش آن با راديکال پروکسيل است .
روش ORAC براي تعيين ظرفيت آنتي اکسيداني عصاره هاي متانولي ميوه گوآوا استفاده شده است . منحني استاندارد براي Trolox بين صفر و ٩٧ ميلي مولار خطي است (اويو و همکاران ، ٦٧٧١ و تاي پونگ و همکاران ، ٦٧٧٣).
١-١-٩- سنجش ظرفيت دفع کنندگي راديکال هيدروکسيل (HORAC :Hydroxyl radical (averting capacity
اين تکنيک بر اندازه گيري ظرفيت کلات کنندگي آنتي اکسيدان ها براي فلزات ، تحت شرايطي مانند واکنش هاي فنتون ، متکي است . روش از يک کمپلکس (Co)II بهره برده و تونايي محافظتي در برابر تشکيل راديکال هيدروکسيل را برآورد مي کند. فلورسئين با نمونه مودر تحليل گرماگذاري شده و سپس مخلوط فنتون که توليد کننده راديکال هاي هيدروکسيل است ، به آن افزوده مي شود. فلورسنس ابتدايي اندازه گيري مي شود. محلول هاي اسيد گاليک براي ساخت منحني استاندارد استفاده شده اند (اويو و همکاران ، ٦٧٧٦).
١-١-٣- سنجش پارامتر آنتي اکسيدان به دام اندازه ي راديکال پروکسيل تام (Total radical-trapping antioxidant parameter : TRAP)
کمولوکينسانس افزايش يافته لومينول براي پايش واکنش هاي مشومل راديکال پروکسيل به کار گرفته شده اند. سيگنال کمولوکينسانس از توليد راديکال هاي مشتق از لومينول ايجاد شده و منتج به تجزيه گرمايي AAPH مي شود.
مقدار TRAP از طول دوره زماني طي شده براي حاموش شدن سيگنال کمولوکينسانس نمونه به دليل حضور آنتي اکسيدان تعيين مي شود (چيزوآ و همکاران ، ٦٧٧١).
١-١-٠- سنجش مهار پرکسيداسيون چربي
روش سنجش مهار پرکسيداسيون چربي از يک سيستم شبه فنتون براي القاي پرکسيداسيون چربي استفاده مي کند.
α- لينولئيک اسيد به عنوان سوبستراي مدل استفاده مي شود. اين سوبسترا با نمونه موردنظر و نيز مخلوط شبه فنتون براي القاي پرکسيداسيون چربي، مخلوط مي شود. پس از پايان گرماگذاري، غلظت مواد واکنش گر- اسيد تيوباربيتوريک (TBARS) به عنوان نمايه اي از پرکسيداسوين چربي اندازه گيري مي شود.
پرکسيداسيون چربي بر اساس نانومول غلظت TBARS در يک ميلي ليتر از مخلوط α- لينولئيک اسيد. نمونه مورد تحليل بيان مي شود (اسلاويکوآ و همکاران ، ١٥٥٢).
١-٦- روش الکتروشيميايي
روش الکتروشيميايي پتانسيل بالايي براي جستجوي ترکيبات آنتي اکسيدانف تعيين ظرفيت آنتي اکسيداني و محتواي آنتي اکسيدان و اندازه گيري نمايه الکتروشيميايي دارد. انواع مختلفي از الکترودها مي توانند به منظور سنجش استفاده شوند. دستگاه ها مي توانند جريان ثابت يا متغير داشته و بر اساس ولتامتري پالسي چرخه اي يا افتراقي و نيز آناليز پوتنشيواستاتيک (potentiostatic) باشند. اين روش ها براي مطلوبيت خود براي کنترل غذا و پايش ظرفيت آنتي اکسيداني در ساير نمونه ها و بسترهاي زيستي شناخته شده هستند.
در ميان روش هاي موجود ولتامتري چرخه اي و آمپرسنجي دوگانه (biamperometry) بوده که به طور گسترده استفاده مي شود.
١-٦-١- ولتامتري چرخه اي
ولتامتري چرخه اي يک نوع اندازه گيري الکتروشيميايي پوتنتيوديناميک (potentiodynamic) است . در آزمايش ولتامتري چرخه اي پتانسيل الکترود به طور خطي در مقابل زمان کار مي کند. در ولتامتري چرخه اي، پتانسيل يک الکترود در حال کار به طور خطي از يک مقدار اوليه تا يک مقدار نهايي و برعکس اسکن شده است ، در حالي که شدت فعلي مربوطه ضبط مي شود.
هنگامي که مقدار يک پتانسيل مجموعه اي دريافت شود، پيچ پتانسيل در الکترود کار معکوس مي شود. اين وارونگي مي توانند چندين بار در طول يک آزمايش اتفاق افتد (چويون و همکاران ، ٦٧٧٧).
جريان در الکترود کار در مقابل ولتاژ اعمال شده براي رسم ولتاگرام چرخه اي (voltammogram) استفاده مي شود. پارامترهاي مهم حاصل از ولتاگرام چرخه اي شدت پيک هاي آنتيوني و کاتيوني، پتانسيل اکسيداسيون آنيوني و پتانسيل اکسايش کاتيوني هستند. همه اين مقادير مي توانند از ولتاگرام استخراج شوند. در مورد سيستم برگشت پذير، مقادير شدت هاي پيک آنيوني و کاتيوني مساوي هستند. براي سيستم برگشت ناپذير، تنها حضور يک پيک روي ولتاگرام قابل ملاحضه است (چويون و همکاران ، ٦٧٧٧). نشان داده شده است که ولتامتري چرخه اي (CV)، به عنوان يک روش راحت است ، براي سنجش کمي از ظرفيت آنتي اکسيداني مواد با وزن مولکولي کم در پلاسماي خون ، هموژنه بافت و عصاره گياهان تأييد شدند. حساسيت روش ، به عنوان شيب نمودار کاليبراسيون در مقابل ويتامين C فرض مي شود.
ظرفيت آنتي اکسيداني عصاره گياهي خشک با ولتامتري چرخه اي تعيين مي شود.
چاي سبز، چاي سياه ، رزماري و قهوه ، انتخاب شدند و براي آزمايش ظرفيت آنتي اکسيداني عصاره هاي خشک مربوطه مورد تجزيه و تحليل قرار گرفتند.
