بخشی از مقاله
چکیده
آنتیاکسیدانها ترکیباتی هستند که برای پیشگیری و یا کند نمودن آسیبهای ناشی از واکنشهای اکسیداسیون در بدن بهکار میروند و به عنوان خنثیکننده رادیکالهای آزاد عمل نموده، و باعث پیشگیری آسیب ناشی از این ترکیبات در بدن میشوند. هدف از این تحقیق بررسی خاصیت آنتیاکسیدانی و تعیین مقدار فنول و فلاونوئید تام در اندامهای هوایی سیلنحبابی و گلاستکانیبرگهدار میباشد.
عصاره متانولی اندام گل در هر دو گیاه سیلنحبابی وگلاستکانیبرگهدار دارای میزان بالاتری از فنول و فلاونوئید تام در مقایسه با سایر اندامهای این گیاهان بودند، همچنین گلو برگِ گلاستکانیبرگهدار واندامِگلِ سیلنحبابی خاصیت آنتیاکسیدانی %100 نشان دادهاند.
مقدمه و هدف
رادیکال آزاد گونهی اتمی یا مولکولی است که بتواند به صورت مستقل وجود داشته باشد و حاوی الکترون منفرد در یکی از اربیتالهای مولکولی خود باشد. رادیکالهای آزاد موجود در بدن شامل گونههای فعال اکسیژندار - ROS - 1 و گونه-های فعال نیتروژندار - RNS - 2 میباشند
تنش اکسایشی عبارت است از شرایطی که در آن تولید گونههای فعال اکسیژن - ROS - بیشتر از آنتیاکسیدانهای دفاعی است و منجر به صدمات به DNA میشوند و در نهایت منجر به مرگ سلولی میگردند. از جمله بیماریهایی که توسط ROS ایجاد میشوند میتوان به سرطان، پارکینسون و آلزایمر اشاره کرد.
گیاهان، سیستم بسیار کارآمد و بهینهای را برای برداشت ROS دارا میباشند. ترکیبات آنتیاکسیدانی گیاهان شامل انواعی از مولکولها - فنولها، کاروتنوییدها و ویتامینها - و آنزیمها - سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیونپراکسیداز - میباشد.
بدن انسان به ترکیبات آنتیاکسیدان نیازمند است، زیرا آنتیاکسیدانها ترکیباتی هستند که مانع فعالیت رادیکالهای آزاد شده و یا سبب حذف آنها میشوند. بنابراین سلولهای بدن را از اثرات مخرب این ترکیبات مصون نگاه میدارند.
شواهد بسیار زیادی وجود دارد که سمی بودن و اثرات سوء تغذیهای آنتیاکسیدانهای سنتزی اضافه شده به مواد غذایی را تأیید میکند، بنابراین نیاز به آنتیاکسیدانهای قوی با سمیت کمتر و اثر بخشی بیشتر یک ضرورت اجتناب-ناپذیر است. آنتیاکسیدانهای طبیعی باعث افزایش قدرت آنتی اکسیدانهای پلاسما و کاهش ابتلا به بعضی بیماریها مانند سرطان، بیماریهای قلبی و سکته مغزی میشوند.
آنتیاکسیدانها در صنعت نیز به عنوان نگهدارنده مواد غذایی در جلوگیری از فساد و تغییر رنگ غذا به کار میروند، از این رو طول عمر مواد غذایی و مدت زمان نگهداری آنها را افزایش میدهند.
توانایی عصارههای مطالعه شده از لحاظ فعالیت آنتی اکسیدانی میتواند حاکی از بیخطر بودن آن جهت تستهای Invivo باشد.
فنولها و ترکیبات فنولیک مثل فلاونوئیدها جزء متابولیتهای ثانویه گیاهان میباشند و به صورت گسترده در بعضی گیاهان وجود دارند که دربردارنده خاصیت آنتیاکسیدانی هستند.[4] توان آنتیاکسیدانی این ترکیبات به خاطر وجود گروههای هیدروکسیل در ساختار حلقه آروماتیک میباشد و با دارا بودن الکترونهای جفت نشدهای که اطراف حلقه وجود دارد، رادیکالهای آزاد را از بین میبرند. مهمترین گروه پلیفنولها، فلاونوئیدها میباشند که با داشتن گروههای هیدروکسیل و متوکسیل باعث خنثی شدن رادیکالهای آزاد میشوند.
تئوری و پیشینه تحقیق
گیاه گلاستکانیبرگهدار - Campanula involucrate - از خانواده گلاستکانی، گیاهانی علفی، یکساله، دوساله یا پایا هستند. بهندرت به صورت بوتههای چوبی، به ارتفاع حدود 1متر مشاهده میشوند و گاهی دارای ساقه بالارونده هستند
این گیاهان در 1600 گونه و 60 جنس تقریبا نزدیک به هم در سراسر جهان پراکنده شدهاند. مهمترین جنس تیره گلاستکانی، کامپانولا میباشد که حدود 250 گونه دارد و مرکز انتشار آن تقریبا نواحی مدیترانهای است. گونههای Codonopsis tangshen وHedraeanthus graminifolius بهترتیب دارای اثرات درمانی پایین آورنده فشار خون و درمان هیستری میباشند.
گیاه سیلن حبابی - Silene Ampullata Bioss - از خانواده Caryophyllaceae و گیاهی یکساله است که اغلب در مکانهای علفی و خشک میروید و مقاوم به خشکسالی و تنش گرمایی است. سیلن بومی حوزه مدیترانه است ، سطح برگهای آن به طور خفیفی کرکدار ، برگها بادامی یا بیضوی شکل وزبر خشن به رنگ سبز درخشان هستند و گلهای آن ساده یا پرپر به صورت خوشهای به رنگ صورتی یا سفید تند هستند این گیاه در فصل بهار و تابستان میروید.
مطالعه حاضر با هدف بررسی اندامها و بخشهای مختلف هوایی گیاهان گل استکانیبرگهدار - Campanula involucrate - و سلین حبابی - Silene Ampullata Bioss - از نظر خاصیت آنتیاکسیدانی و یافتن اندام حاوی ماده موثرتر است.
مواد و روشها
مواد شیمیایی وبیوشیمیایی
عصاره هگزانی گیاهان مورد نظر، متانول - حلال خریداری شده از شرکت مرک - ، آسکوربیک اسید - خریداری شده از شرکت مرک - ، دی فنیل پیکریل هیدرازیل1 خریداری شده از شرکت سیگما . - DPPH - کوئرستین، استات پتاسیم، آلومینیوم کلراید، فولین سیوکالتو، اسید گالیک، سدیم کربنات، پتاسیم فریسیانید، تریکلرو استیک اسید، آهن کلراید
جمع آوری گیاهان
شناسایی اندامهای هوایی - برگ، گل و ساقه - دو گیاه خاکشیر و شاهتره مورد بررسی، توسط نظر مهندس معروفی ارشد سیستماتیک گیاهی انجام پذیرفت. بدین طریق که در فصل بهار گیاهان از کوههای اطراف سنندج، جمعآوری و به آزمایشگاه تحقیقاتی منتقل گردیدند. سپس اندامهای هوایی هر دو گیاه از همدیگر تفکیک شدند این اندامهای تفکیک شده در شرایطی امن از نظر آلودگی میکروبی، قارچی و به دور از نور آفتاب، به مدت چند روز به طور کامل خشک گردیدند. در این مدت نمونهها از لحاظ کیفیت روند خشک شدن کنترل میشدند.
اندازه گیری فنل تام عصاره ها
میزان کل ترکیبات فنولی با روش فولین سیوکالتو1 توسط شهیدی و ناچک[8] با کمی تغییرات اندازهگیری شد. یک میلیگرم از هر یک از اندامهای هوایی گیاه در 10 میلیلیتر متانول حل شد تا نمونه کشت 100ppm ایجاد شود. فراکسیون-های 0/5 میلیلیتر - سه گانه - در لوله آزمایش ریخته شد و بعد 0/5 میلیلیتر معرف فولین سیوکالتو به لولهها اضافه و به مدت 2 دقیقه همزده، سپس10 میلیلیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه شد. جذب نمونهها پس از یک ساعت قرار دادن نمونهها در دمای 45 درجه سانتیگراد با دستگاه اسپکتروفتومتر در 765 نانومتر اندازهگیری شد و آزمایشات برای عصاره و استاندارد سه بار تکرار شد.
برای رسم منحنی استاندارد اسید گالیک، محلول پایهای از این ماده با غلظت 100 میکروگرم بر میلیلیتر تهیه شد سپس از این غلظت، غلظتهای مختلف 100 - ، 80، 60، 40، 20، 10، - 0 بر حسب میکروگرم بر میلیلیتر تهیه شد. پس از طی کردن مراحل مختلف طبق روش مذکور جذب نمونهها قرائت شد.
براساس یک نمودار کالیبراسیون اسید گالیک، با به دست آوردن معادله خطی منحنی استاندارد و قرار داد جذب عصاره در آن، مقدار فنول تام عصاره اندازه-گیری شد. در پایان محتوای فنول تام بصورت معادل اسید گالیک در گرم عصاره بیان شد. روش فولین سیوکالتو یک روش مهم برای اندازهگیری مقدار فنول موجود در عصاره میباشد که اساس این روش احیا معرف فولین سیوکالتو توسط ترکیبات فنولی موجود در عصاره و تشکیل کمپلکس آبی رنگ میباشد که ماکزیمم جذب را در 765 نانومتر دارد.
اندازه گیری فلاونوئید تام عصاره
فلاونوئید تام با روش ایجاد رنگ آلومینیوم کلراید توسط چانگ- یانگ[9] با کمی تغییرات اندازهگیری شد. طبق این روش، 0/1 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره هر یک از اندامهای هوایی دو گیاه تهیه شد. 0/5 میلیلیتر از نمونه در 1/5 میلی-لیتر متانول حل شد. سپس 0/1 میلیلیتر آلومینیوم کلراید 10 درصد، 0/1 میلیلیتر استات پتاسیم 1 مولار و 2/8 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. جذب مخلوط در 415 نانومتر قرائت شد. از کوئرستین به عنوان رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج براساس میلیگرم معادل کوئرستین در گرم عصاره بیان شد.
بدین صورت که ابتدا یک محلول از کوئرستین با غلظت 100 میکروگرم بر میلیلیتر تهیه شد. سپس غلظتهای دیگر 100 - ، 80، 60، 40، 20، 10، - 0 بر حسب میکروگرم بر میلیلیتر به دست آمد. براساس یک نمودار کالیبراسیون کوئرستین2، با به دست آوردن معادله خط و قرار دادن جذب عصاره در آن، مقدار فلاونوئید تام عصاره ارزیابی شد. آزمایشات 3 بار تکرار شد و میانگین این تکرارها گزارش شد. اساس این روش رنگ ایجاد شده توسط کمپلکس اسیدی ایجاد شده آلومینیوم کلراید با گروه هیدروکسیل فلاونوئیدهاست و در صورت وجود فلاونوئید در عصاره این کمپلکس ایجاد میشود که بیشترین جذب را در طول موج 415 نانومتر دارد.
ارزیابی رادیکال آزاد DPPH توسط ماده موجود در عصاره
جهت تعیین فعالیت آنتیاکسیدانی در این تحقیق از روش فو و همکارانش استفاده گردید. تمامی سنجشها در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم نهایی 200میکرولیتر گزارش شد.
