بخشی از مقاله
چکیده
رادیکالهای آزاد و استرس اکسیداتیو ناشی از آنها باعث ایجاد اختلالاتی در بدن میشوند. یکی از راهکارهای از بین بردن رادیکالهای آزاد و پیشگیری از عوارض این رادیکالها، استفاده از آنتیاکسیدانهای طبیعی میباشد. هدف از این تحقیق بررسی خاصیت آنتیاکسیدانی و تعیین مقدار فنول و فلاونوئید تام در اندامهای هوایی خاکشیر و شاهتره بود. نتایج به دست آمده و آنالیزهای آماری نشان داد که عصاره هگزانی گلِخاکشیر و برگِ شاهتره حاوی مقدار بالایی از فنول و فلاونوئید هستند. همچنین به دلیل EC50 پایینتر قدرت مهار رادیکال آزاد بیشتر و در نتیجه فعالیت آنتیاکسیدانی بالاتری از سایر اندامهای هوایی داشتند.
مقدمه و هدف
نقش فیزیولوژیک آنتیاکسیدانها، جلوگیری از وارد شدن آسیب ناشی از واکنشهای شیمیایی رادیکالهای آزاد است، به اجزای سلولی میباشد.
در حال حاضر نتایج مطالعات بالینی نشان میدهد که استرس اکسیداتیو ناشی از گونه-های فعال اکسیژن و نیتروژن در انواع اختلالات، سرطان و پیری نقش دارد. در واقع مطالعات زیادی نشان میدهد که آنتی-اکسیدانها دارای اثر مهاری قوی در برابر آسیبهای اکسیداتیو هستند .
آنتی اکسیدانها ممکن است اثراتشان را با عملکردهای مختلفی مانندسرکوبِ تشکیل گونههای فعال با کاهش هیدروپراکسیداز و هیدروژن پراکسید، از بین بردن رادیکالهای آزاد فعال و تعمیر یا پاکسازی آسیب اعمال کنند.
آنتی اکسیدانهای شیمیایی مانند بوتیلیدهیدروکسیآنیزول1 - BHA - و بوتیلیدهیدروکسیتولوئن - BHT - 2 که برای حفظ و ثبات ارزش غذایی، به عنوان افزودنیهای غذایی و در تولید غذاهای جانوری مورد استفاده میباشند، میتوانند در حیوانات آزمایشگاهی باعث ایجاد سرطان شوند.
در بدن سیستمهای آنتیاکسیدانی مانند آنزیمهای سوپراکسیددیسموتاز،کاتالاز؛ ماکرومولکولهایی مثل آلبومین، سرولوپلاسمین و سایر مولکولهای کوچک مثل آسکوربیکاسید، آلفاتوکوفرول و بتاکاروتن وجود دارند که میتوانند با رادیکالهای آزاد مقابله کنند.
اگرچه آنتیاکسیدانها در بدن وجود دارند اما برای از بین بردن رادیکالهای آزاد در بدن باید از آنتیاکسیدانهای اگزوژن هم که از طریق مواد غذایی به دست میآیند، استفاده شود[6]اخیراَ. تحقیقات زیادی در زمینهی نقش آنتی-اکسیدانها در رژیم غذایی مورد توجه قرار گرفته است به عنوان مثال رژیمهای غذایی که سرشار از میوهها و سبزیجات هستند به خاطر دارا بودن مواد آنتیاکسیدانی، ریسک ابتلا به بیماریهای کرونر قلب و سرطان را پایین میآورند.
مطالعاتی که بر روی گیاهان دارویی درحال انجام است، نشان میدهد که گیاهان دارویی به خاطر خواص آنتیاکسیدانی قوی و مقرون بهصرفه از لحاظ اقتصادی موضوعات پژوهشی مناسبی در حال حاضر میباشند.[8] خواص آنتیاکسیدانی گیاهان در درجه ی اول به حضور ترکیبات فنلی موجود در آنها برمیگردد .[9] بسیاری از این ترکیبات آنتیاکسیدانی دارای اثرات ضدالتهابی، ضدتومور، ضدسرطان و یا فعالیتهای ویروسی میباشند.[10] فنولها و ترکیبات فنولیک مثل فلاونوئیدها جزء متابولیتهای ثانویه گیاهان میباشند و به صورت گسترده در بعضی گیاهان وجود دارند که دربردارنده خاصیت آنتیاکسیدانی هستند.
توان آنتیاکسیدانی این ترکیبات به دلیل وجود گروههای هیدروکسیل در ساختار حلقه آروماتیک میباشد و با دارا بودن الکترونهای جفت نشدهای که اطراف حلقه وجود دارد، رادیکالهای آزاد را از بین میبرند.
مهمترین گروه پلیفنولها، فلاونوئیدها میباشند که با داشتن گروههای هیدروکسیل و متوکسیل باعث خنثی شدن رادیکالهای آزاد می-شوند.
تئوری و پیشینه تحقیق
گیاه خاکشیر با نام علمی Descurainia Sophia از خانوائه چلیپائیان و گیاهی یکساله به ارتفاع 20 تا 60 سانتیمتر با کاسبرگهای حاوی غدههای مویی است.
خاکشیر بومی مناطق شمال آفریقا و جنوب اروپا میباشد اما در شمال شرقی چین به صورت وسیعی یافت میشود و در ایران بیشتر در نواحی غرب و شمال پراکندگی دارد.[15] خاکشیر غنی از ترکیبات پلیفنول است و تعداد زیادی از این ترکیبات مانند فلاونوئید، کومارین و سولفورگلیکوزیدها به دلیل دارا بودن خاصیت آنتیاکسیدانی معروف میباشند.
شاهتره نیز با نام علمی Fumaria vaillantii از خانواده فوماریاسه و گیاهی یکساله با طولی در حدود 24 اینچ با گلهای سفید یا کمرنگ صورتی است.
گیاه کامل شاهتره حاوی چندین ترکیب آلکالوئید و فلاون هتروزید مانند آدلومین1، فوماریلین 2 و فوماریتین3 میباشد که به گیاه خاصیت آنتیاکسیدانی دادهاند.
با توجه به اینکه توان بالقوه آنتیاکسیدانی برای هر دو گیاه گزارش شده است اما هیچ گزارشی برای بررسی خاصیت آنتی-اکسیدانی در بخشهای هوایی دو گیاه صورت نگرفته است. بنابراین، با در نظر گرفتن خصوصیات ذکر شده برای دو گیاه، هدف از این تحقیق ضمن اندازهگیری محتوای تام فنولی و تام فلاونوئیدی، بررسی توان آنتیاکسیدانی احیاء آهن4 و ارزیابی خاصیت آنتیاکسیدانی توسط دیفنیل پیکریل هیدرازیل - DPPH - 5 در عصارههای هگزانی اندامهای هوایی دو گیاه میباشد.
مواد و روشها
مواد شیمیایی و بیوشیمیایی
دیفنیل پیکریل هیدرازیل، آسکوربیک اسید، کوئرستین، استات پتاسیم، آلومینیوم کلراید، فولین سیوکالتو، اسید گالیک، سدیم کربنات، پتاسیم فریسیانید، تریکلرو استیک اسید، آهن کلراید - III - از نمایندگیهای شرکت مرک خریداری شدند.
جمع آوری نمونه های گیاهی
اندامهای هوایی گیاهان خاکشیر و شاهتره در ماههای اردیبهشت و خرداد از مناطق مختلف استان کردستان جمع-آوری و جهت شناسایی و رده بندی به مرکز تحقیقات کشاورزی استان ارسال شدند. سپس به آزمایشگاه تحقیقاتی گروه علوم زیستی منتقل و اندامهای هوایی هر دو گیاه از همدیگر تفکیک شدند این اندامهای تفکیک شده در شرایطی امن از نظر آلودگی میکروبی، قارچی و به دور از نور آفتاب، به مدت چند روز به طور کامل خشک گردیدند. در این مدت نمونهها از لحاظ کیفیت روند خشک شدن کنترل میشدند.
تهیهی عصاره هگزانی
جهت تهیهی عصاره هگزانی هر کدام از اندامها، میزان 40 گرم از پودر آنها را وزن کرده و درون یک ظرف شیشه-ای تیره ریخته و سپس مقدار 200 میلی لیتر حلال ان-هگزان به آن افزوده شد. این مخلوط به مدت 24 ساعت در دمای اتاق نگهداری شد و سپس توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف شده و باقیمانده جامد دور ریخته میشد و قسمت صاف شده برای به دست آوردن عصاره خالص مورد استفاده قرار میگرفت. مایع صاف شده توسط دستگاه روتاری اواپراتور در 68 درجه سانتیگراد و 50 دور در دقیقه بسته به میزان محلول صاف شده 25 تا 40 دقیقه تغلیظ میشد. سپس عصاره تغلیظ شده را بر روی شیشه ساعت به قطر 15 سانتیمتر پخش کرده و در زیر هود تا خشک شدن کامل و تبخیر حلال ان- هگزان - که معمولاَ 48 تا 72 ساعت طول میکشید - نگهداری شد. پس از حصول اطمینان از صحت خشک شدن عصارهها، با استفاده از یک تیغ تیز عصارهها را جمعآوری و در میکروتیوبهای 1/5 میلیلیتری تا زمان سنجش در فریزر -18 نگهداری شدند.
اندازه گیری فنل تام عصارهها
میزان کل ترکیبات فنولی با روش فولین سیوکالتو1 و مطابق پروتوکول شهیدی و ناچک با کمی تغییرات اندازهگیری شد. یک میلیگرم از هر یک از اندامهای هوایی گیاه در 10 میلیلیتر متانول حل شد تا نمونه کشت 100ppm ایجاد شود. فراکسیونهای 0/5 میلیلیتر - سه گانه - در لوله آزمایش ریخته شد و بعد 0/5 میلیلیتر معرف فولین سیوکالتو به لولهها اضافه و به مدت 2 دقیقه همزده شد . سپس 10 میلیلیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه شد. جذب نمونهها پس از یک ساعت قرار دادن نمونهها در دمای 45 درجه سانتیگراد با دستگاه اسپکتروفتومتر در 765 نانومتر اندازهگیری شد و آزمایشات برای عصاره و استاندارد سه بار تکرار شد.
اندازه گیری فلاونوئید تام عصاره
فلاونوئید تام با روش ایجاد رنگ آلومینیوم کلراید و مطابق پروتوکول توسط چانگ- یانگ با کمی تغییرات اندازه-گیری شد. طبق این روش، محلول 0/1 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره هر یک از اندامهای هوایی دو گیاه تهیه شد. 0/5 میلیلیتر از نمونه در 1/5 میلیلیتر متانول حل شد. سپس 0/1 میلیلیتر آلومینیوم کلراید 10 درصد، 0/1 میلیلیتر استات پتاسیم 1 مولار و 2/8 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت و جذب خوانده شد. جذب مخلوط در 415 نانومتر قرائت شد. از کوئرستین به عنوان رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج براساس میلیگرم معادل کوئرستین2 در گرم عصاره بیان شد.
بررسی فعالیت آنتیاکسیدان عصارهها از طریق مهار رادیکال آزاد DPPH
جهت بررسی فعالیت آنتیاکسیدان و مهار رادیکال آزاد DPPH در این تحقیق از روش فو - Rao-Fu - و همکارانش استفاده شد.[21] سنجشها در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم کل 200 میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیتخوان تکن مدل سانرایز3 به ترتیب زیر انجام شد. ابتدا 100 میکرولیتر از محلول 0/1 میلیمولار DPPH - حل شده در متانول - به چاهکها افزوده شد و سپس مقدار 100 میکرولیتر از غلظتهای مختلف عصاره به آن افزوده شد. آنگاه به مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد انکوبه شد. از محلول DPPH به عنوان کنترل منفی نیز استفاده گردید. بعد از گذشت 30 دقیقه، جذب در طول موج 517 نانومتر اندازهگیری شد.
از آسکوربیک اسید بهعنوان کنترل مثبت استفاده گردید. پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهکهای متناظرش کسر شده و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه شد. فعالیت آنتیاکسیدانی برای سه تکرار هر عصاره محاسبه و در پایان میانگین گرفته شد. درنهایت مقدار به دام اندازی رادیکال DPPH با فرمول زیر محاسبه شد.
